In vitro štúdie - vlastnosti, výhody a nevýhody. Integrovaný prístup k štúdiu farmakologických látok in vitro, ex vivo, in vivo Čo je to in vitro in vivo

- „v (na) živom organizme“), to znamená „vo vnútri živého organizmu“ alebo „vo vnútri bunky“.

Vo vede in vivo sa vzťahuje na vykonávanie experimentov na (alebo vo vnútri) živého tkaniva v živom organizme. Toto použitie termínu vylučuje použitie časti živého organizmu (ako sa to robí v testoch in vitro) alebo pomocou mŕtveho organizmu. Testovanie na zvieratách a klinické skúšky sú formy výskumu in vivo.

pozri tiež

Napíšte recenziu na článok „In vivo“

Úryvok charakterizujúci in vivo

Hlavná akcia bitky pri Borodine sa odohrala v priestore tisícich sazhenov medzi Borodinom a fleches Bagration. (Mimo tohto priestoru sa na jednej strane uskutočnila ukážka Uvarovovej kavalérie zo strany Rusov uprostred dňa, na druhej strane za Utitsou došlo k stretu Poniatowského s Tučkovom; išlo však o dve samostatné resp. slabé akcie v porovnaní s tým, čo sa stalo uprostred bojiska.) Na poli medzi Borodinom a flushmi, blízko lesa, na otvorenom a viditeľnom úseku z oboch strán, sa hlavná akcia bitky odohrala v najjednoduchšom najnenáročnejším spôsobom.

Selezneva A.I. 1 , Kalatanová A.V. 2 , Afonkina O.V. 3

1 Kandidát lekárskych vied, Senior Researcher, 2 Junior Researcher, 3 Junior Researcher, St. Petersburg Institute of Pharmacy CJSC

INTEGROVANÝ PRÍSTUP K ŠTÚDIU FARMAKOLOGICKÝCH LÁTOKIN VITRO, EX VIVO, IN VIVO

anotácia

Článok sa zaoberá - efektívnym plánovaním a možnosťami vykonávania experimentálnych štúdií zahŕňajúcich optimálny rozsah metód na stanovenie možných smerov pôsobenia farmakologických látokv in vitro, napr vivo, v vivo. Konečným cieľom integrovaného využívania batérie metód je získať spoľahlivé a dostatočné experimentálne údaje, znížiť objem, náklady a čas výskumu prostredníctvom kompetentného rozvoja dizajnu výskumu a využitia údajov získaných v každej fáze.

Kľúčové slová: skríning, predklinické štúdie, lieky, farmakologická látka, účinnosť, bezpečnosť, in vitro, ex vivo, in vivo.

Selezneva A.I. 1 , Kalatanová A.V. 2 , Afonkina O.V. 3

1 kandidát na lekárske vedy, hlavný výskumník, 2 mladší výskumník, 3 mladší výskumník, „Inštitút farmácie v Saint-Petersburgu“

KOMPLEXNÝ PRÍSTUP K ŠTÚDIU FARMAKOLOGICKÝCH LÁTOK IN VITRO, EX VIVO, IN VIVO

Abstraktné

Článok uvažuje o efektívnom plánovaní a možnostiach experimentálnych štúdií zahŕňajúcich optimálny rozsah metód na identifikáciu možných oblastí pôsobenia farmakologických látok in vitro, ex vivo, in vivo. Konečným cieľom integrovaného použitia súboru metód je poskytnúť spoľahlivé a dostatočné experimentálne údaje, znížiť objem, náklady a načasovanie štúdie kompetentným návrhom štúdie a využitím údajov zozbieraných v každej fáze.

Kľúčové slová: skríning, predklinické štúdie, lieky, farmakologické činidlo, účinnosť, bezpečnosť, in vitro, ex vivo, in vivo.

Úspešná štúdia účinnosti a bezpečnosti farmakologických látok priamo závisí od kompetentného plánovania a vývoja dizajnu štúdie. Existuje veľké množstvo metód na skríning aj objemové hodnotenie možného smeru účinku a toxických vlastností farmakologických látok. Tieto metódy možno podmienečne definovať do troch skupín podľa spôsobov ich realizácie - metódy in vitro, ex vivo, in vivo.

Metódy in vitro zahŕňajú skríning alebo objemové hodnotenie účinnosti a bezpečnosti farmakologických látok v modelových systémoch s použitím reakčných médií, enzýmov, bunkových línií a pod. v oblasti humánneho zaobchádzania so zvieratami. Obmedzujúce štúdie účinnosti a bezpečnosti farmakologických látok metódami in vitro sa však neodporúčajú, pretože extrapolácia získaných výsledkov na celý organizmus sa vyznačuje vysokým rizikom.

Metódy ex vivo sú spravidla izolované orgány a tkanivá živých organizmov. Tieto metódy sú tiež všeobecne známe a údaje zo štúdií ex vivo majú tendenciu byť klinicky relevantnejšie. Rovnako ako metódy in vitro však výsledky štúdií ex vivo nemôžu byť základom pre začatie klinických skúšok farmakologickej látky.

Metódy in vivo sú klasické pre experimentálnu farmakológiu a predstavujú štúdie na rôznych druhoch a líniách zvierat. Metódy in vivo poskytujú spoľahlivé a dostatočné výsledky, ktoré možno úspešne extrapolovať na kliniku. Existuje veľké množstvo údajov o anatomických, fyziologických, biochemických a iných vlastnostiach druhov a línií pokusných zvierat, ktoré umožňujú určiť stupeň relevantnosti pre ľudí a predpovedať výsledky klinických skúšok farmakologických látok. Napriek vysokej informatívnosti štúdií in vivo však najúspešnejší prístup k vývoju dizajnu štúdie môžu poskytnúť výsledky štúdií in vitro a ex vivo. Tieto metódy zároveň umožňujú výrazne znížiť počet zvierat v pokuse, čo má kľúčový význam z hľadiska bioetiky.

V tomto príspevku sú identifikované možné možnosti komplexného hodnotenia účinnosti farmakologických látok pomocou batérie metód in vitro, ex vivo a in vivo. Použitie integrovaného prístupu umožňuje, aby bola experimentálna štúdia čo najinformatívnejšia a najspoľahlivejšia.

Komplexné hodnotenie účinnosti farmakologických látokv in vitro, napr vivoav vivo

Pre štúdium účinnosti farmakologických látok má osobitný význam skríning farmakologickej aktivity, pilotné štúdie a štúdium mechanizmov účinku. Takže nové farmakologické látky možno syntetizovať alebo získať z prírodných surovín rôznymi metódami, možno izolovať veľké množstvo stereoizomérov alebo látok, ktoré sa líšia štruktúrou jednou alebo viacerými funkčnými skupinami. Uskutočniť plnohodnotné štúdium každého z kandidátov si vyžaduje veľa času, ekonomických nákladov a využitie veľkého množstva zvierat. Použitie metód in vitro a ex vivo vo väčšine prípadov umožňuje vybrať najsľubnejších kandidátov a znížiť objem výskumu.

Štúdia in vivo poskytuje objemové údaje, ktoré sú optimálne na extrapoláciu na kliniku. Použitie rôznych modelov chorôb u zvierat, ako aj použitie geneticky modifikovaných druhov prispieva k vytvoreniu mechanizmov farmakologického účinku, účinných dávok, dynamiky hodnôt patologických markerov pri dlhodobom používaní. , atď.

Ako príklad uvádzame komplexnú štúdiu účinnosti farmakologickej látky X, ktorá má potenciálne antioxidačné a kardioprotektívne vlastnosti, v systéme metód in vitro, ex vivo a in vivo.

Návrh štúdie je uvedený v tabuľke 1.

Tabuľka 1 - Návrh komplexnej štúdie účinnosti farmakologickej látky X

V prvej fáze štúdia mechanizmov účinku in vitro sa zistilo, že farmakologická látka X sa vyznačuje výraznou účinnosťou vo vzťahu k hydroxylovému radikálu a peroxidácii lipidov (tabuľka 2).

Tabuľka 2 - Účinnosť farmakologickej látky X v štúdiách in vitro

Účinnosť farmakologickej látky X prevyšovala účinnosť referenčného lieku Y.

Zistilo sa, že prítomnosť antioxidačných vlastností farmakologickej látky určuje jej cytoprotektívne vlastnosti. Početné klinické a experimentálne štúdie ukázali, že oxidačný stres hrá kľúčovú úlohu vo vývoji kardiovaskulárnych patológií, ako je ochorenie koronárnych artérií, hypertenzia, ateroskleróza, koronárna insuficiencia a srdcové zlyhanie.

Výsledky štúdií in vitro umožnili určiť hlavné smery experimentálneho dizajnu ex vivo a in vivo, ako aj stanoviť možné mechanizmy účinku farmakologickej látky.

Druhou etapou výskumu bolo zistenie kardioprotektívnych vlastností farmakologickej látky X v ex vivo experimente uskutočnenom na izolovanom srdci Langendorffovou metódou. Štúdia sa uskutočnila s použitím farmakologickej látky X v troch dávkach.

Výsledkom druhej etapy výskumu bolo zistenie, že hodnoty tlaku (LVP) a rýchlosti kontrakcie (dP/dt max) ľavej komory na pozadí ischémie s následnou reperfúziou izolovaného srdca sa zvyšujú štatisticky významne, čo môže naznačovať pozitívny inotropný účinok lieku (obr. 1).

Ryža. 1 - Účinnosť farmakologickej látky X v štúdii ex vivo.

Údaje získané v štúdii in vitro a ex vivo dávajú dôvod predpokladať kľúčový mechanizmus účinku a farmakologický účinok látky, a preto plánovať experimenty in vivo.

Keďže in vitro a ex vivo bola farmakologická látka X charakterizovaná výraznou kardioprotektívnou aktivitou, ako aj účinkom na antioxidačný systém, boli vyvinuté modely kardiovaskulárnych patológií, ktorých patogenéza je spojená s oxidačným stresom a zhoršenou kontraktilitou myokardu. vybrané na štúdium špecifickej aktivity in vivo: akútny infarkt myokardu a arteriálna hypertenzia.

Ako výsledok štúdií účinnosti farmakologickej látky X in vivo na modeli akútneho infarktu myokardu sa zistil vplyv na fyziologické a biochemické parametre simulovanej patológie (tabuľka 3).

Tabuľka 3 - Účinnosť farmakologickej látky X na pozadí modelovania akútneho infarktu myokardu u potkanov, M ± m.

V dôsledku štúdií účinnosti farmakologickej látky X in vivo u spontánne hypertenzných potkanov bol pozorovaný výrazný pokles systolického (SBP) a diastolického (DBP) krvného tlaku pred použitím farmakologickej látky X aj 1 hodinu po (tabuľka 4).

Tabuľka 4 - Zmena krvného tlaku v priebehu užívania farmakologickej látky X

Poznámka - * p ‹ 0,05 v porovnaní s kontrolnou skupinou

Výsledkom použitia komplexného hodnotenia in vitro, ex vivo a in vivo sa teda zistila vysoká účinnosť novej farmakologickej látky X a boli určené možné mechanizmy účinku. Kardiotonické a kardioprotektívne účinky lieku boli stanovené na modeli izolovaného srdca pomocou Langendorffovej metódy a pri modelovaní akútneho experimentálneho infarktu myokardu in vivo. Pri použití nového lieku u zvierat so spontánnou hypertenziou sa pozoroval trvalý pokles krvného tlaku, ako aj zníženie počiatočných hodnôt tlaku na konci liečby. Zistilo sa, že kľúčovú úlohu pri realizácii farmakologických účinkov farmakologickej látky X zohráva jej antioxidačná aktivita, ktorá bola potvrdená v štúdiách antiradikálovej a redukčnej schopnosti in vitro.

Použitie metód in vitro a ex vivo umožnilo výrazne znížiť objem pokusných zvierat, keďže na základe ich výsledkov boli vybrané efektívne dávky farmakologickej látky X a najvhodnejšie experimentálne modely.

Literatúra

1. Menshchikova E.B. Oxidačný stres: Patologické stavy a choroby. - Novosibirsk: ARTA, 2008. 284 s.;
2. Toropova Ya.G. Perfúzia izolovaného srdca metódou Langendorff a Nilli: možnosti aplikácie vo vedeckom výskume / Ya.G. Toropová, N.Yu. Osyaev, R.A. Mukhamadiyarov // Translačná medicína. - 2014. Číslo 4 - S. 34-39.

Referencie

1. Russell W.M.S., Burch, R.L. Princípy humánnej experimentálnej techniky. – Londýn: Methuen & Co. 238 str.;
2. Smernica Európskeho parlamentu a Rady 2010/63/EÚ z 22. septembra 2010 o ochrane zvierat používaných na vedecké účely // Úradný vestník Európskej únie. 2010. S. 33 - 79;
3. Humánna veda v 21. storočí: abstrakty 9. svetového kongresu, Praha, 2014. Ročník 3, č. 1. 336 s.;
4. Mathers J. Antioxidačné a cytoprotektívne reakcie na redoxný stres // Biochem Soc Symp.- Vol. 71. – S.157-176;
5. Addabbo F. Mitochondrie a druhy reaktívneho kyslíka / F. Addabbo, M. Montagnani, M.S. Goligorsky // Hypertenzia. – 2009. 53. – S. 885-892;
6. Pánska shhikova E.B. Okislitel'nyj stres: Patologicheskie sostojanija i zabolevanija. - Novosibirsk: ARTA, 2008. 284 s;
7. Toropová Ja.G. Perfuzija izolirovannogo serdca metodom Langendorf i Nilli: vozmozhnosti primenenija v nauchnyh issledovanijah / Ja.G. Toropová, N.Ju. Osjaev, R.A. Muhamadijarov // Transljacionnaja medicina. - 2014. Číslo 4 - S. 34-39.

Výskum sa vykonáva na mikroorganizmoch, bunkách alebo biologických molekulách mimo ich normálneho biologického kontextu. Hovorovo sa označujú ako pokusy v skúmavke. Tieto štúdie v biológii a jej subdisciplínach sa tradične uskutočňovali v skúmavkách, bankách, Petriho miskách atď. a od začiatku molekulárnej biológie zahŕňali metódy, takzvané omiky. Štúdie využívajúce zložky organizmu izolované z ich normálneho biologického prostredia sú podrobnejšie a pohodlnejšie ako analýzy s celými organizmami. Na rozdiel od toho sa štúdie in vivo vykonávajú na zvieratách vrátane ľudí a celých rastlín.

Príklady

Príklady štúdií in vitro: izolácia, rast a identifikácia buniek odvodených z mnohobunkových organizmov (bunková kultúra alebo tkanivová kultúra); subcelulárne zložky (mitochondrie alebo ribozómy); bunkové alebo subcelulárne extrakty (napr. extrakty z pšeničných klíčkov alebo retikulocytov); purifikované molekuly, ako sú proteíny, DNA alebo RNA); a priemyselná výroba antibiotík a liečiv. Vírusy, ktoré sa replikujú iba v živých bunkách, sa študujú v laboratóriu v bunkovej alebo tkanivovej kultúre a mnohí zoovirológovia to označujú ako prácu in vitro, aby ju odlíšili od práce in vivo na celých zvieratách.

• Polymerázová reťazová reakcia je metóda na selektívnu replikáciu špecifických sekvencií DNA a RNA v skúmavke.
• Purifikácia proteínu je izolácia špecifického proteínu z komplexnej zmesi, ktorá sa v mnohých prípadoch získava z homogenizovaných buniek alebo tkanív.
• In vitro fertilizácia sa uskutočňuje v pohári pomocou spermií a vajíčka. Oplodnené embryo (embryá) sa potom implantujú do maternice nastávajúcej matky.
• In vitro diagnostika je široká škála lekárskych a veterinárnych laboratórnych testov. Sú nevyhnutné na diagnostiku chorôb a sledovanie klinického stavu pacientov a materiálom sú krvné vzorky, bunky či iné tkanivá pacienta.

Testovanie in vitro sa používa na charakterizáciu špecifickej adsorpcie, distribúcie, metabolizmu a vylučovania (ARME) liečiv alebo bežných chemikálií v živom organizme. Napríklad experimenty s bunkami Caco-2 pomôžu posúdiť absorpciu zlúčenín cez sliznicu gastrointestinálneho traktu. Na štúdium distribučných mechanizmov je možné určiť rozdelenie spojení medzi orgánmi. Suspenzia alebo kultivácia primárnych hepatocytov alebo bunkových línií podobných hepatocytom (HepG2, HepaRG) sa môže použiť na štúdium a kvantifikáciu chemického metabolizmu. Tieto parametre procesov ARME sa potom môžu integrovať do takzvaných "fyziologicky založených farmakokinetických modelov" alebo PMPO.

Video o štúdiách in vitro

Výhody in vitro

Štúdie in vitro umožňujú druhovo špecifickú, jednoduchšiu, pohodlnejšiu a podrobnejšiu analýzu ako analýza celého tela. Tak ako štúdie na celých zvieratách čoraz viac nahrádzajú štúdie na ľuďoch, štúdie in vitro nahrádzajú celé štúdie na zvieratách.

Jednoduchosť

Živé organizmy sú mimoriadne zložité funkčné systémy tvorené desiatkami tisíc génov, molekúl proteínov a RNA, anorganických iónov malých organických zlúčenín a komplexov. Prostredie, v ktorom sa nachádzajú, je priestorovo organizované membránami a u mnohobunkových organizmov sú za to zodpovedné orgány a systémy. Tieto nespočetné komponenty interagujú medzi sebou a s prostredím, aby spracovávali jedlo, odstraňovali odpad, presúvali komponenty na správne miesto a reagujú na signálne molekuly, svetlo, iné organizmy, teplo, zvuk, chuť, rovnováhu a dotyk.

Táto zložitosť sťažuje určenie vzťahov medzi jednotlivými zložkami, ako aj štúdium základných biologických funkcií. Práca in vitro zjednodušuje skúmaný systém, takže výskumník sa môže sústrediť na malý počet komponentov.

Napríklad identifikácia proteínov imunitného systému (ako sú protilátky) a mechanizmus, ktorým rozpoznávajú a viažu sa na cudzie antigény, by zostali nejasné. Rozšírené využitie práce in vitro však umožnilo izolovať proteíny, identifikovať bunky a gény, ktoré ich produkujú, a študovať fyzikálne vlastnosti interakcie s antigénmi. Okrem toho bolo možné určiť, ako táto interakcia vedie k bunkovým signálom, ktoré aktivujú ďalšie zložky imunitného systému.

Druhová špecifickosť

Ďalšou výhodou metód in vitro je, že ľudské bunky možno študovať bez "extrapolácie" z bunkovej odpovede experimentálneho zvieraťa.

Pohodlie, automatizácia

Metódy in vitro možno miniaturizovať a automatizovať, čo poskytuje vysokovýkonné skríningové metódy na testovanie molekúl v toxikológii alebo farmakológii.

nevýhody

Hlavnou nevýhodou experimentálnych štúdií in vitro je, že je ťažké extrapolovať výsledky práce späť na biológiu intaktného organizmu. Aby sa zabránilo prehnanej interpretácii výsledkov, výskumníci in vitro musia byť opatrní. To môže viesť k chybným záverom o biológii organizmu a systému.

Napríklad vedci, ktorí vyvíjajú nový vírusový liek na liečbu infekcie patogénnym vírusom (napr. HIV-1), môžu dospieť k záveru, že potenciálny liek slúži na zabránenie replikácie vírusu in vitro (zvyčajne v bunkovej kultúre). Pred použitím lieku v klinickom prostredí sa však musí podrobiť sérii testov in vivo, aby sa určila jeho bezpečnosť a účinnosť v intaktných organizmoch (zvyčajne postupne u malých zvierat, primátov a ľudí). Vo všeobecnosti väčšina kandidátov na liečivá, ktoré sú účinné in vitro, nie sú účinné in vivo kvôli problémom s podávaním liečiva do chorých tkanív, toxicite pre dôležité časti tela, ktoré neboli zohľadnené v pôvodných štúdiách in vitro, alebo iným problémom.

Extrapolácia z in vitro na in vivo (IVIVE)

Výsledky získané z experimentov in vitro sa zvyčajne nedajú transformovať na predpovedanie reakcie celého tela in vivo. Preto je mimoriadne dôležité vyvinúť konzistentný a spoľahlivý postup extrapolácie z výsledkov in vitro na výsledky in vivo. Vo všeobecnosti boli prijaté dve rozhodnutia:

• Zvyšujúca sa zložitosť systémov in vitro na reprodukciu tkanív a interakciu medzi nimi (ako v systémoch „muž na čipe“).
• Použitie matematického modelovania na numerickú simuláciu správania komplexného systému, kde údaje in vitro poskytujú hodnoty parametrov modelu.

Tieto dva prístupy nie sú nezlučiteľné: vylepšené systémy in vitro poskytnú presnejšie údaje pre matematické modely. Na druhej strane, stále sofistikovanejšie experimenty in vitro zhromažďujú stále početnejšie, komplexnejšie a sľubné údaje na integráciu. Tu potrebujeme matematické modely, ako napríklad v systémovej biológii.

Extrapolácia vo farmakológii

Vo farmakológii môžu byť IVIVE štúdie použité na aproximáciu farmakokinetiky (PK) alebo farmakodynamiky (PD). Keďže čas a intenzita expozície danému cieľu závisia od času koncentrácie toku potenciálneho liečiva (príbuznej molekuly alebo metabolitov) do cieľového miesta, citlivosť tkanív a orgánov in vivo môže byť úplne odlišná, resp. opak toho, čo bolo pozorované na kultivovaných bunkách in vitro. To naznačuje, že extrapolačné účinky pozorované in vitro vyžadujú kvantitatívny in vivo PK model. Všeobecne sa uznáva, že fyziologicky založené PK modely (BFM) hrajú ústrednú úlohu pri extrapolácii.

V prípade skorých účinkov alebo účinkov bez medzibunkovej komunikácie sa predpokladá, že rovnaká koncentrácia bunkovej expozície spôsobí rovnaké účinky z kvalitatívneho a kvantitatívneho hľadiska, in vitro a in vivo. V tejto situácii stačí vyvinúť jednoduchý PD model vzťahu dávka-odozva in vitro a transponovať ho bez zmeny na predpovedanie účinkov in vivo.