Ak enzýmový imunotest nepotvrdil hiv. ELISA je spoľahlivá metóda na diagnostiku HIV. Ako a kde vziať IFA. Ako urobiť analýzu

Infekcia vírusom ľudskej imunodeficiencie je vážna diagnóza. Chyby v diagnostike môžu viesť k katastrofálnym následkom. Analýza ELISA na HIV je najdostupnejšou výskumnou metódou, ale nie je vo všetkých prípadoch informatívna.

ELISA - enzýmová imunoanalýza. Úlohou metódy ELISA je detekcia protilátok proti vírusu imunodeficiencie v biologickom materiáli. Pomocou tejto metódy je možné sledovať prítomnosť v kvapaline nie samotných vírusov, ale iba protilátok produkovaných v reakcii na ich prítomnosť. ELISA sa široko používa pri diagnostike pohlavne prenosných chorôb. Pomáha identifikovať sexuálne prenosné choroby.

Existuje niekoľko typov ELISA: priamy variant, nepriamy variant, sendvičová metóda. V každom prípade je technika založená na stanovení prítomnosti protilátok, ktoré slúžia ako indikátor prieniku cudzieho agens. Na odhalenie týchto „známok“ je biologická zložka ošetrená enzýmami.

ELISA deteguje protilátky s presnosťou 96 - 98%, chyba je zanedbateľná. Je to 2-4%.

ELISA - metóda na diagnostiku HIV

Analýza ELISA na HIV je prvou fázou diagnózy. Antigénmi vírusu imunodeficiencie sú proteíny p24, p15, p17, p31 a glykoproteíny gp 41, gp55, gp66, gp120, gp160.

Na detekciu vírusového proteínu sa časť krvi odoberie zo žily. Vzorka odoslaná na krvný test ELISA sa ošetrí reagenciami na enzýmovú imunoanalýzu. Sérum sa izoluje z krvi. Ak sa počas štúdie zistia, vírus je už prítomný v krvi.

Krv sa podáva striktne na prázdny žalúdok. 2 dni pred analýzou sa neodporúča jesť mastné jedlá a piť alkohol. Antivírusové lieky by ste mali prestať užívať do 14 dní.

Výhody metódy:

• relatívne nízke náklady;
• vysoká stabilita činidiel;
• vysoká citlivosť;
• krátky dodací čas;
• minimálny vplyv ľudského faktora.

Moderné testovacie systémy pre ELISA sú vyrábané podľa svetových štandardov. To zlepšuje presnosť metódy.

ELISA nie vždy poskytuje spoľahlivé výsledky. Po vstupe vírusu do krvi začína latentné (skryté) štádium vývoja. Obdobie, kým sa vírusy nezačnú množiť a protilátky sa ešte nevytvoria, sa nazýva „čas séronegatívneho okna“. V tejto fáze je zbytočné robiť ELISA. Ak dôjde k infekcii, výsledkom bude . Ako rýchlo sa vírus deteguje, závisí od toho, koľko nebezpečných buniek sa dostalo do tela. Pri nechránenom pohlavnom styku alebo transfúzii infikovanej krvi bude toto obdobie minimálne.

Pre vysokú spoľahlivosť testu ELISA na HIV sa štúdia uskutočňuje trikrát. Termíny testu ELISA na vírus ľudskej imunodeficiencie:

• 6 týždňov po pravdepodobnom kontakte,
• za 3 mesiace,
• o šesť mesiacov neskôr.

ELISA 4. generácie na HIV je najinformatívnejšia metóda v počiatočných štádiách infekcie. Môže sa vykonať už 1 mesiac po údajnej infekcii. Test je v porovnaní s náprotivkom 3. generácie drahý. Preto sa vo verejných zdravotníckych zariadeniach používa ako doplnková diagnostická metóda. Bezplatne sa vykonáva test 3. Ak na základe jeho výsledkov nie je možné dať jednoznačnú odpoveď, pacient je odoslaný na ELISA 4. generácie.

Dôležité! Ihneď po infekcii sa človek stane nákazlivým. Pre ostatných je nebezpečný, aj keď o svojej diagnóze ešte nevie!

Ak sa počas testu ELISA zistia protilátky proti antigénom HIV, sú potrebné ďalšie štúdie. K týmto patrí. Spoľahlivosť tejto metódy je 80%. Pomocou PCR sa vyšetruje krv, sperma a vaginálny výtok. Biologická tekutina sa rozdelí v lekárskom reaktore a potom sa podrobí enzymatickej úprave. V dôsledku toho sa získajú údaje o koncentrácii buniek HIV v kvapalnom médiu. Kvôli veľkej chybe (20%) s pozitívnym výsledkom sa dodatočne vykonáva imunitný blotting.

Ďalším diagnostickým krokom je Combo test (alebo imunitný blotting). Ide o vysoko citlivú štúdiu (spoľahlivosť 98 %) a mala by sa vykonať, ak sú výsledky ELISA po 6 mesiacoch nepresvedčivé.

Interpretácia výsledkov ELISA

Doba dešifrovania je od 24 do 48 hodín. Ak je potrebné urýchlene získať informácie (vyžaduje sa chirurgický zákrok), dekódovanie sa uskutoční do 2 hodín. Provinčné lekárske stanice nemajú vždy potrebné reagencie. Vzorka sa odoberie v mieste obehu, potom sa prenesie do regionálneho centra. Za takýchto okolností možno výsledok zistiť za 1-2 týždne.

Výsledok enzýmového imunotestu môže byť pozitívny alebo negatívny; nie sú žiadne iné možnosti.

Aj keď bol výsledok počas primárneho a opakovaného testu ELISA pozitívny, pacient nemôže byť rozpoznaný ako infikovaný HIV. Možná chyba. Dôvody falošne pozitívneho výsledku:

• chronické choroby;
• dlhotrvajúce infekčné choroby;
• tehotenstva.

Preto by sa mal výsledok analýzy objasniť dodatočnými štúdiami.

Ak počas imunoblotingu na HIV (reaktívny) sa osoba považuje za infikovanú HIV, čo znamená, že je zdravá.

Bunky vírusu sa nakoniec prispôsobia predpísaným liekom. Na kontrolu sa test ELISA periodicky opakuje.

Niekedy imunoblotting ukazuje falošne negatívny výsledok. Extrémne zriedkavý vírus imunodeficiencie 6 mesiacov (alebo viac). To je možné, ak sa do krvného obehu dostalo malé množstvo vírusových buniek. V 0,5 % z celkového počtu prípadov je možné infekciu diagnostikovať až po roku. V 99,5%, do šiestich mesiacov po infekcii, ELISA poskytne spoľahlivý výsledok.

Dokonca aj pri vysoko presných štúdiách stále existuje odchýlka 2 %. Netreba zabúdať ani na ľudský faktor. Aby sa eliminovala možnosť chyby, test je možné vykonať v 2 rôznych inštitúciách.

Na vykonanie komplexného hodnotenia stavu tela sa používa diagnostická metóda ELISA. Krvný test ELISA je určený na diagnostiku infekčných, hematologických, primárnych a sekundárnych imunodeficiencií.

Čo je analýza ELISA

Mnoho pacientov sa zaujíma o metódu ELISA: čo to je, na čo je štúdia. Enzýmová imunoanalýza sa začala používať relatívne nedávno. Spočiatku sa používal na štúdium antigénnych štruktúr a vykonával sa iba na vedecké účely. Potom vedci dospeli k záveru, že pomocou enzýmov je možné identifikovať špecifické protilátky, ktoré vznikajú ako odpoveď na prebiehajúce ochorenie.

Spočiatku túto techniku ​​používali iba úzkoprofilové zdravotnícke zariadenia, hlavne na transfúznych staniciach krvi. Zvlášť dôležitá je metóda ELISA na detekciu infekcie HIV.

Dnes má táto metóda široké uplatnenie. Moderné laboratóriá ho používajú na diagnostiku:

• nádory;
• hormonálne poruchy;
• infekcie;
• chronické alebo predtým prenesené infekčné procesy;
• helmintov.

Ak sa v tele vyskytne infekčný proces, potom sa tento typ diagnózy považuje za najoptimálnejší na určenie typu ochorenia.

Podstata metódy a jej typy

Metóda ELISA - čo to je, čo je podstatou tohto typu výskumu? Táto a mnohé ďalšie otázky zaujímajú pacientov. Základom tejto diagnostickej metódy je väzba imunitných buniek organizmu na antigény infekčných agens. Výsledný komplex sa stanoví pomocou špeciálneho enzýmu.

Aby ste pochopili princíp metódy ELISA, musíte vedieť, ako prebieha reakcia antigén-protilátka. Antigén je molekula proteínu cudzia pre telo, ktorá vstupuje spolu s infekciou. Za antigény sa považujú aj častice cudzej krvi, ktoré sa nezhodujú v skupine. V organizme vyvolávajú imunitnú odpoveď zameranú na ochranu pred cudzorodými látkami. Preto ľudské telo produkuje protilátky - imunoglobulíny, ktoré sa môžu naviazať na antigény a vytvoriť tak imunitný komplex. Takéto zlúčeniny sú oveľa ľahšie rozpoznateľné a zničené imunitnými bunkami.

Reakcia na prítomnosť takýchto imunokomplexov sa uskutočňuje v laboratóriu s použitím hotových zlúčenín, aby sa zistilo, či sú v krvi podobné.

Podstata metódy ELISA je pomerne jednoduchá, ale vzhľadom na to, že sa vykonáva krvný test na zistenie mnohých infekcií a chorôb, existuje niekoľko jej odrôd. Každá sa líši v schéme správania a rozsahu. Môže to byť priama alebo nepriama ELISA. Priama metóda znamená, že sa používajú imobilizované protilátky, ktoré reagujú s antigénmi. Hlavnou výhodou tejto metódy je, že všetky procesy môžu byť automatizované, čo znamená, že diagnostika trvá trochu času.

Nepriama metóda znamená, že sa používajú sekundárne protilátky. A na pevnej fáze je antigén imobilizovaný. Analýza vám umožňuje určiť protilátky proti rôznym antigénom. To pomáha dosiahnuť presnejší výsledok, ale metóda je zložitá.

Študijné výhody

Metóda ELISA má oproti iným diagnostickým metódam mnoho výhod. Medzi hlavné patria:

• vysoká citlivosť;
• stabilita počas skladovania zložiek;
• rýchlosť diagnostiky;
• možno použiť malé množstvo testovacieho materiálu;
• je možné automatizovať všetky procesy;
• infekciu možno zistiť v počiatočnom štádiu.

Táto diagnostická metóda je univerzálna, preto je vhodná na hromadné vyšetrenie. Pomocou analýzy je možné sledovať dynamiku priebehu infekčného procesu.

Indikácie pre analýzu a odber vzoriek materiálu

Vykonanie štúdie pomocou metódy ELISA možno predpísať, ak existuje podozrenie na rôzne ochorenia:

Venózna krv sa vyšetruje na prítomnosť protilátok. Pred analýzou sa z nej izolujú prvky, ktoré môžu skomplikovať štúdiu. Môžu sa odoberať aj iné biologické tekutiny.

Na získanie čo najpresnejších informácií sa odber krvi vykonáva na prázdny žalúdok. Ak bol postup predpísaný na určenie latentnej infekcie, niekoľko týždňov pred analýzou by ste mali prestať užívať antibakteriálne a antivírusové lieky. V závislosti od vybavenia laboratória, kde bol materiál odobratý, je možné výsledok získať do jedného dňa. V núdzových prípadoch sa tento čas skráti na niekoľko hodín.

Analýza na syfilis

Použitie metódy ELISA pomáha určiť prítomnosť mnohých infekcií v tele, najmä syfilisu. Pre štúdiu sa krv odoberá z žily na prázdny žalúdok. Potom sa uskutoční štúdia, ktorá pomáha určiť nielen prítomnosť choroby v tele, ale aj presné načasovanie jej nástupu, pretože v priebehu choroby sú niektoré protilátky nahradené inými v presne definovanom poradí.

V akútnej fáze naznačujúcej predĺžený priebeh ochorenia alebo pri exacerbácii chronickej infekcie sa v krvi zistia imunoglobulíny typu M. Prítomnosť imunoglobulínov typu A naznačuje, že infekcia žije v tele viac ako 4. týždňov. Imunoglobulíny skupiny G indikujú výšku ochorenia alebo predchádzajúcu liečbu.

Podľa stupňa zafarbenia jamiek sa hodnotí intenzita infekčného procesu, pretože jeho saturácia závisí od počtu vytvorených imunitných komplexov.

HIV test

Na analýzu sa v tomto prípade používa aj metóda ELISA, ktorá má určité znaky, ktoré súvisia s priebehom a progresiou ochorenia. Táto výskumná metóda sa považuje za najprijateľnejšiu na stanovenie, mala by sa však vykonať najskôr mesiac po vystavení rizikovým faktorom. Je to spôsobené prítomnosťou inkubačnej doby, ktorá trvá od 45 dní do 6 mesiacov. Preto je potrebné analýzu po šiestich mesiacoch zopakovať.

• askarióza;
• giardiáza;
• toxoplazmóza atď.

Napriek všetkým výhodám má metóda ELISA aj nevýhody. Hlavnou nevýhodou je, že pri vykonávaní štúdie musí mať lekár vopred predpoklad o chorobe.

Keď neexistuje spôsob, ako náhodne nájsť patogén a určiť jeho vlastnosti enzýmového imunotestu. Test indikuje iba prítomnosť protilátok v krvi pacienta. Navyše je to dosť nákladná analýza.

Dešifrovanie analýzy

Výsledkom kvalitatívnej ELISA bude buď prítomnosť protilátok, alebo ich neprítomnosť v krvi. Ak sa vykonáva kvantitatívna analýza, potom môže byť koncentrácia protilátok vyjadrená buď v číselnej hodnote alebo v určitom počte znakov +.

Okrem toho ukazovatele ako:

Indikátor IgM indikuje priebeh akútneho infekčného procesu v tele. Jeho úplná absencia môže naznačovať neprítomnosť pôvodcu ochorenia alebo jeho prechod do chronického štádia.

Hodnota IgA s negatívnym testom IgM naznačuje chronickú alebo latentnú infekciu. Súčasná prítomnosť IgM a IgA naznačuje, že ochorenie je v akútnom štádiu. Prítomnosť IgG naznačuje prechod choroby do chronického štádia alebo úplné zotavenie a rozvoj imunity.

Teraz existujú špeciálne testy ELISA, ktoré si môžete urobiť sami.

ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA - anglicky) vstúpila do života praktickej medicíny niekde inde v 60. rokoch minulého storočia. Jeho prvotnou úlohou bol histologický výskum na vedecké účely, ktorý sa obmedzoval na hľadanie a identifikáciu antigénnej štruktúry buniek živého organizmu.

Metóda ELISA je založená na interakcii špecifických (AT) a príbuzných antigénov (AG) s tvorbou komplexu antigén-protilátka, ktorý sa deteguje pomocou enzýmu. Táto skutočnosť viedla vedcov k myšlienke, že metódu možno použiť na diagnostické účely na identifikáciu špecifických imunoglobulínov rôznych tried podieľajúcich sa na imunitnej odpovedi na konkrétnu infekciu. A bol to prelom v klinickej laboratórnej diagnostike!

Metóda sa začala aktívne používať až začiatkom 80-tych rokov a potom najmä v špecializovaných inštitúciách. Prvé enzýmové imunosorbentové analyzátory boli dodané do krvných transfúznych centier a staníc, infekčných a pohlavných nemocníc, keďže na obzore sa s nami objavil hrozivý AIDS, ktorý sa narodil na africkom kontinente a okamžite sa pridal k „starým“ infekciám, vyžadoval okamžité opatrenia. na diagnostiku a vyhľadávanie terapeutických liekov, ktoré ho ovplyvňujú.

Rozsah metódy ELISA

Možnosti enzýmovej imunoanalýzy sú skutočne rozsiahle. Teraz je ťažké si predstaviť, ako sa možno zaobísť bez takýchto štúdií, ktoré sa používajú doslova vo všetkých odvetviach medicíny. Zdá sa, že ELISA môže robiť v onkológii? Ukazuje sa, že môže. A veľa. Schopnosť analýzy nájsť markery charakteristické pre určité typy malígnych novotvarov je základom včasnej detekcie nádoru, keď ešte nie je detekovaný inými metódami pre svoju malú veľkosť.

Moderná klinická laboratórna diagnostika (CDL) má okrem nádorových markerov aj významný arzenál panelov pre ELISA a využíva ich na diagnostiku rôznych patologických stavov (infekčné procesy, hormonálne poruchy) a sledovanie farmaceutických liekov s cieľom identifikovať ich vplyv na pacientov telo a, mimochodom, nielen človeka. V súčasnosti je enzýmová imunoanalýza široko používaná vo veterinárnej službe, pretože „naši menší bratia“ sú tiež náchylní na mnohé choroby, ktorými niekedy veľmi trpia.

teda ELISA vďaka svojej citlivosti a špecifickosti dokáže zo vzorky krvi odobratej zo žily určiť:

• Hormonálny stav (hormóny štítnej žľazy a nadobličiek, pohlavné hormóny);
• Prítomnosť vírusovej a bakteriálnej infekcie (HIV, B a C, chlamýdie, syfilis, a, a, rovnako ako mnoho ďalších chorôb spôsobených patogénnymi mikroorganizmami);
• Stopy vitálnej aktivity mikroorganizmov, ktoré iniciovali infekčný proces, ktorý sa úspešne skončil a prešiel do štádia tvorby imunitnej odpovede na tento patogén. Takéto stopy, teda protilátky, zostávajú v mnohých prípadoch cirkulovať v krvi po celý život, čo človeka chráni pred opätovnou infekciou.

Čo je podstatou IF?

Enzýmová imunoanalýza umožňuje určiť nielen prítomnosť samotného patogénu (kvalitatívnou analýzou), ale aj jeho kvantitatívny obsah v krvnom sére pacienta.

Vírusová alebo bakteriálna dávka výrazne ovplyvňuje priebeh infekčného procesu a jeho výsledok, preto kvantitatívna analýza zohráva dôležitú úlohu v diagnostike a liečbe ochorení v rôznych formách a štádiách.

Keď však poznáme enzýmové imunoanalýzy ako metódu ELISA, ani sa nezamýšľame nad tým, ako dokáže pokryť také široké spektrum mikroorganizmov obývajúcich našu planétu, z ktorých mnohé predstavujú priamu hrozbu pre zdravie a životy ľudí. zvierat. Faktom je, že ELISA má veľa možností (nesúťažných a konkurenčných - priamych a nepriamych), z ktorých každá rieši svoj vlastný problém a umožňuje tak cielené vyhľadávanie.

Na detekciu imunoglobulínov jednej alebo druhej triedy sa používa tradičný 96-jamkový polystyrénový panel (tableta), v jamkách ktorého sú koncentrované adsorbované rekombinantné proteíny v tuhej fáze. Protilátky alebo antigény, ktoré sa dostali do jamky s krvným sérom, nájdu „známy“ predmet a vytvoria s ním komplex (AG - AT), ktorý sa fixovaný enzýmovým konjugátom prejaví ako zmena farby jamky. pri čítaní výsledkov.

Enzýmová imunoanalýza sa vykonáva na testovacích systémoch určitej špecifickosti, vyrobených v špeciálnych laboratóriách a vybavených všetkými potrebnými reagujúcimi zložkami. Štúdie sa môžu vykonávať pomocou podložiek ("podložiek") a čítacích spektrofotometrov, kde je väčšina manuálnej práce. Na plnoautomatických strojoch, ktoré oslobodia laboranta od monotónnej instilácie, umývania a iných rutinných úkonov, je samozrejme práca rýchlejšia a pohodlnejšia, no nie všetky laboratóriá si môžu dovoliť taký luxus a pokračovať v práci po starom. - na poloautomatických zariadeniach.

Interpretácia výsledkov ELISA je v kompetencii lekára laboratórnej diagnostiky, pričom sa nevyhnutne berie do úvahy vlastnosť, ktorá je vlastná takmer všetkým imunochemickým reakciám dávať falošne pozitívne alebo falošne negatívne odpovede.

Video: moderný enzýmový imunotest

ELISA výsledky na príklade syfilisu

ELISA je vhodná na detekciu všetkých foriem a okrem toho sa používa v skríningových štúdiách. Na analýzu sa používa venózna krv pacienta odobratá nalačno. V práci sú použité platne s určitou špecifickosťou (AT triedy A, M, G) alebo celkové protilátky.

Vzhľadom na to, že protilátky v syfilise sú produkované v špecifickej sekvencii, ELISA môže ľahko odpovedať na otázku, kedy došlo k infekcii a v akom štádiu je proces, a dekódovanie získaných výsledkov môže byť prezentované v nasledujúcej forme:

• IgM indikujú trvanie infekčného procesu (môže sa objaviť počas exacerbácie chronických zápalových ochorení);
• IgA uvádza, že k infekcii došlo pred viac ako mesiacom;
• IgG naznačujú, že infekcia je v plnom prúde alebo nedávna liečba, čo sa dá ľahko zistiť pri zbere anamnézy.

Pri testovaní na syfilis zostanú negatívne jamky (a negatívna kontrola) bezfarebné, zatiaľ čo pozitívne (ako pozitívna kontrola) budú vykazovať jasne žltú farbu v dôsledku zmeny farby chromogénu pridaného počas testu. Intenzita farby však nie vždy zodpovedá kontrole, to znamená, že môže byť mierne bledšia alebo mierne žltkastá. Ide o pochybné výsledky, ktoré spravidla podliehajú opätovnému skúmaniu s povinným zohľadnením kvantitatívnych ukazovateľov získaných na spektrofotometri, ale vo všeobecnosti je farba priamo úmerná počtu imunitných komplexov (antigénov a protilátok spojených s navzájom).

Najzaujímavejšie z enzýmových imunotestov - ELISA na HIV

Analýzy možno viac ako iné zaujímajú široké spektrum obyvateľstva, pretože zatiaľ nie je možné s istotou povedať, že mnohé sociálne problémy (prostitúcia, drogová závislosť atď.) vymizli. Žiaľ, HIV postihuje nielen tieto vrstvy ľudskej spoločnosti, nakaziť sa môžete za rôznych okolností, ktoré nesúvisia so sexuálnou promiskuitou alebo užívaním drog. Ak je však potrebný test HIV, nemali by ste sa báť, že sa o návšteve takéhoto laboratória dozvedia všetci naokolo. Teraz sú ľudia infikovaní HIV chránení zákonom a tí, ktorí majú pochybnosti, sa môžu obrátiť na anonymné úrady, kde môžu problém vyriešiť bez strachu z publicity a odsúdenia.

Enzýmová imunoanalýza používaná na diagnostiku HIV infekcie je jednou z primárnych štandardných štúdií, ktoré si však vyžadujú špeciálne podmienky, keďže téma je veľmi citlivá.

Má zmysel vykonávať ELISA na HIV po sexuálnom kontakte, transfúzii krvi, iných lekárskych zákrokoch, ktoré zahŕňajú infekciu, a na konci inkubačnej doby („séronegatívne okno“), ale treba mať na pamäti, že toto časové obdobie nie je konštantná. Môže skončiť za 14-30 dní, prípadne môže trvať až šesť mesiacov, preto sa za priemernú hodnotu považuje interval od 45 do 90 dní. Na HIV sa krv daruje rovnako ako pri iných infekciách – zo žily nalačno. Výsledky budú pripravené v závislosti od akumulácie materiálu v laboratóriu a jeho pracovného zaťaženia (od 2 do 10 dní), hoci väčšina laboratórií poskytuje odpoveď v ten istý alebo nasledujúci deň.

Čo možno očakávať od výsledkov HIV?

ELISA na infekciu HIV zisťuje protilátky proti dvom typom vírusu: HIV-1 (bežnejší v Rusku a iných európskych a ázijských krajinách) a HIV-2 (častejší v západnej Afrike).

Úlohou HIV ELISA je vyhľadávanie protilátok triedy G, ktoré sú detegované na všetkých testovacích systémoch, ale v neskoršom období, a protilátok triedy A a M, detekovaných na rekombinantných testovacích súpravách novej generácie, ktoré umožňujú detekovať protilátky pri v najskorších štádiách (inkubačná doba je séronegatívne okno). Od testu ELISA možno očakávať nasledujúce odpovede:

1. Primárny pozitívny výsledok: krv je podrobená opätovnej kontrole na testovacom systéme rovnakého typu, ale ak je to možné, inej série a inou osobou (laborantom);
2. Opakované (+) zahŕňa nový odber krvi od pacienta s jej štúdiom podobným primárnej analýze;
3. Ďalší pozitívny výsledok podlieha referenčnej analýze, ktorá využíva vysoko špecifické testovacie súpravy (2-3 ks);
4. Pozitívny výsledok v oboch (alebo troch) systémoch sa odošle na imunoblotovanie (rovnaká ELISA, ale vykonaná individuálne na testovacích súpravách s obzvlášť vysokou špecifickosťou).

Záver o infekcii HIV sa robí len na základe imunoblotingu. Rozhovor s infikovanou osobou prebieha úplne dôverne. Vyzradenie lekárskeho tajomstva v Rusku, ako aj v iných krajinách, je trestne stíhané.

Mimoriadnu obľubu si získali aj testy na chlamýdie a cytomegalovírusy pomocou enzýmovej imunoanalýzy, pretože umožňujú určiť čas infekcie, štádium ochorenia a účinnosť terapeutických opatrení.

Počas úvodu je tiež možné pozorovať výskyt protilátok rôznych tried. v rôznych fázach patologického stavu spôsobeného infekčným agensom:

• IgM možno zistiť už sedem dní po infekcii;
• IgA naznačujú, že infekcia žije v tele viac ako mesiac;
• IgG potvrdzuje diagnózu chlamýdií, pomáha sledovať liečbu a určovať jej účinnosť. Je potrebné poznamenať, že protilátky triedy G zostávajú a cirkulujú v tele bez ohľadu na trvanie ochorenia, preto je pre správnu interpretáciu analýzy potrebné vziať do úvahy referenčné hodnoty (normy), ktoré spôsob, sú odlišné pre každý CDL: berúc do úvahy značku testovacieho systému a špecifickosť činidiel zahrnutých v súprave. Normálne hodnoty sa zadávajú do formulára vedľa výsledku ELISA.

Čo sa týka, tu je to trochu inak: protilátky triedy M sa objavia asi za mesiac a pol, to znamená, že pozitívny výsledok (IgM +) sa dostane vo fáze primárnej infekcie alebo počas reaktivácie latentnej infekcie a zostane tak od 4 mesiacov do šiestich mesiacov.

Prítomnosť protilátok triedy G je charakteristická pre nástup primárnej akútnej infekcie alebo reinfekcie. Analýza uvádza, že vírus je prítomný, ale neposkytuje informácie o štádiu infekčného procesu. Ťažkosti však spôsobuje aj stanovenie normy titra IgG, pretože úplne závisí od imunitného stavu konkrétnej osoby, ktorý je však stanovený detekciou imunoglobulínov triedy G. Vzhľadom na toto správanie protilátok sa pri diagnostike CMVI stáva potrebné na posúdenie schopnosti protilátok triedy G interagovať s CMV, aby ho neskôr „neutralizovali“ (AT avidita). V počiatočnom štádiu ochorenia sa IgG veľmi zle viažu na antigény vírusu (nízka avidita) a až potom začnú vykazovať aktivitu, preto môžeme hovoriť o zvýšení avidity protilátok.

O výhodách enzýmovej imunoanalýzy sa môžeme baviť už dlho, pretože touto metódou sa podarilo vyriešiť mnohé diagnostické problémy len s použitím venóznej krvi. Odpadá dlhé čakanie, starosti a problémy s odberom materiálu na výskum. Okrem toho sa testovacie systémy pre ELISA neustále zlepšujú a deň, keď test poskytne 100% spoľahlivosť výsledku, nie je ďaleko.

Video: vzdelávací film Moskovskej štátnej lekárskej univerzity. Sechenov o základoch ELISA

A.P. OBRYADINA, T.I. ULANOVA
LLC "Vedecké a výrobné združenie "Diagnostické systémy",

Nižný Novgorod
ENZYMOVÉ IMUNITNÉ TESTOVACIE SYSTÉMY "DS-ELISA-HBeAg" a "DS-ELISA-anti-HBe" PRE ŠPECIFICKÚ DIAGNOSTIKU A PREDPOVEĎ VÝSLEDKOV AKÚTNEJ A CHRONICKEJ HEPATITÍDY B
Hepatitída B je vírusové infekčné ochorenie charakterizované ťažkým

zápalové ochorenie pečene. Približne 1 % úmrtí sa vyskytuje v

akútne obdobie ochorenia, v 4-10% prípadov dochádza k transformácii na chronickú

proces s možnou tvorbou následnej cirhózy pečene a primár

hepatokarcinómy.

Napriek klesajúcemu trendu vo výskyte akútnej hepatitídy B sa naďalej tvorí epidemiologicky nebezpečná skupina pacientov, u ktorých je chronická vírusová hepatitída diagnostikovaná prvýkrát, ako aj skupina nosičov pôvodcu ochorenia. Nepriaznivá prognóza zostáva spojená s vysokým výskytom hepatitídy B medzi populáciou v reprodukčnom veku, ako aj medzi adolescentmi.

Preto sú v súčasnosti obzvlášť aktuálne otázky liečby, prevencie a diagnostiky hepatitídy B. V súčasnosti sa na detekciu markerov tejto infekcie široko používajú metódy enzýmovej imunoanalýzy. Medzi najdôležitejšie sérologické markery HBV patrí e-antigén (HBeAg) a protilátky proti e-antigénu (anti-HBe). HBeAg sa spája s vysokou infekciou krvi, čo naznačuje aktívnu replikáciu vírusu hepatitídy B (HBV). Zistilo sa, že vysoké titre HBeAg zodpovedajú vysokej aktivite DNA polymerázy a sú vždy kombinované s detekciou kompletných častíc Dane. Keď sa sérum s obsahom HBeAg dostane do krvi zdravého človeka, riziko infekcie je o mnoho rádov vyššie ako po sérokonverzii.

Pri akútnej hepatitíde B sa HBeAg zisťuje v krvi vo včasných štádiách infekčného procesu už pri prvých klinických prejavoch ochorenia, týždeň po objavení sa HBsAg. Akútna hepatitída B (AHV) cyklického priebehu je charakterizovaná krátkodobou cirkuláciou HBeAg. Čoskoro, po 2-3 týždňoch ikterického obdobia, sa objaví anti-HBe, čo umožňuje predpovedať priaznivý výsledok ochorenia.

Anti-HBe cirkuluje v krvi 2-5 rokov, menej často niekoľko mesiacov.

Nástup sérokonverzie HBeAg-antiHBe znamená prudký pokles aktivity

infekčný proces. Detekcia HBeAg v krvi pacientov po 2 mesiacoch ochorenia naznačuje chronicitu patologického procesu. V tomto prípade sa anti-HBe môže vytvoriť mnoho rokov po objavení sa protilátok proti HBcAg alebo sa vôbec nezistí.

Výskyt anti-HBe môže mať nepriaznivú prognostickú hodnotu v

akútne obdobie HBV pri ťažkých formách, čo zodpovedá mutácii v pre-core zóne s

tvorba kmeňa "e-" HBV.

cieľ táto práca bola vývojom vysoko citlivých a špecifických

Testovacie systémy ELISA na detekciu HBeAg a anti-HBe a hodnotenie ich hlavných charakteristík.

Materiály a metódy.

1. Systém enzýmového imunotestu „DS-ELISA-HBeAg“. Platný začiatok testu

sú kozie polyklonálne protilátky proti rekombinantnému HBeAg, vyrábané NPO Diagnostic Systems, Nižný Novgorod, adsorbované na pevnej fáze, a konjugát, ktorým sú kozie polyklonálne protilátky proti rekombinantnému HBeAg, značené chrenovou peroxidázou, vyrábané NPO Diagnostic Systems, Nižný Novgorod. Schéma analýzy je jednostupňový "sendvič" Celkový reakčný čas je 1,5 hodiny. Vzorka séra sa analyzuje nezriedená.

2. Testovací systém ELISA „DS-ELISA-anti-HBe“. Základom testu je

rekombinantný HBeAg (AHBV 102), vyrobený spoločnosťou NPO Diagnostic Systems,

Nižný Novgorod, adsorbovaný na pevnej fáze a anti-IgG konjugát s chrenovou peroxidázou, vyrábaný Sorbent Service, Moskva. Reakcia prebieha v dvoch stupňoch. Testované sérum sa pridá k imobilizovanému antigénu v riedení 1/10 a po inkubácii a odstránení nenaviazaných zložiek sa detegujú špecifické imunokomplexy pomocou myších monoklonálnych protilátok proti ľudskému IgG značených chrenovou peroxidázou.

3. Na vyhodnotenie vyvinutých testovacích systémov bolo použitých 2178 vzoriek séra

krvi. Z toho 480 vzoriek bolo od zdravých darcov. 1680 vzoriek predstavuje

sú vzorky krvného séra obsahujúce rôzne markery vírusu hepatitídy B.

V priebehu času sa získalo 18 vzoriek od pacientov s klinickou diagnózou akútnej vírusovej hepatitídy B. Predtým boli všetky vzorky testované na prítomnosť HBsAg, HBeAg, anti-HBe, anti-HBc pomocou testovacích systémov vyrobených spoločnosťou NPO Diagnostic Systems, Nižný Novgorod: "ELISA-HBsAg / m", "DS-ELISA-HBeAg", " DS-ELISA-anti-HBe", "ELISA-anti-HBc".

4. Porovnávacie hodnotenie vyvinutých testovacích systémov sa uskutočnilo pomocou

komerčný liek "Monolisa HBe", vyrábaný spoločnosťou BIO-RAD, Francúzsko;

Výsledky a diskusia. NPO "Diagnostic Systems" vyvinula 2 nové diagnostické súpravy: "DS-ELISA-HBeAg" a "DS-ELISA-anti-HBe". Testovací systém "DS-ELISA-HBeAg" je určený na detekciu e-antigénu vírusu hepatitídy B v sére (plazme) ľudskej krvi pomocou enzýmovej imunoanalýzy a môže byť použitý na špecifickú diagnostiku, stanovenie aktivity infekčného procesu. predpovedá závažnosť a výsledok hepatitídy B.

Testovací systém „DS-ELISA-anti-HBe“ je určený na detekciu IgG protilátok proti e-antigénu vírusu hepatitídy B v ľudskom sére (plazme) a môže byť

Používa sa na predpovedanie priebehu infekčného procesu a sledovanie prebiehajúcej liečby hepatitídy B.

Na preskúmanie špecifickosti nových testov sa odhadla distribúcia

optická hustota (OD) vzoriek krvného séra obsahujúcich a neobsahujúcich

HBeAg alebo anti-HBe. Boli použité vzorky krvného séra od zdravých darcov a vzorky krvného séra vybrané pre rôzne markery vírusu hepatitídy B.

krvné transfúzne stanice. Výsledky štúdie ukázali výrazné oddelenie týchto dvoch populácií. Hodnoty OD vzoriek séra neobsahujúcich HBeAg sa pohybovali od 0,011 do 0,111 a hlavný vrchol vzoriek séra obsahujúcich HBeAg sa pohyboval od 2,186 do 3,186 (obrázok 1a).

Obr.1a. Distribúcia OD vzoriek séra obsahujúcich a neobsahujúcichHBeAgv testovacom systéme "DS-ELISA-HBeAg»
Vrcholom zodpovedajúcim skupine sér s nízkou OD (0,3-0,6) sú pravdepodobne vzorky séra odobraté v počiatočných štádiách infekčného procesu.

Už v inkubačnej dobe sú HBsAg a HBeAg pravidelne registrované v krvi pacientov, čo potvrdzuje ich potenciálnu epidemiologickú nebezpečnosť.

Rozsah optickej hustoty vzoriek séra neobsahujúcich anti-HBe

bola v rozsahu od 0,002 do 0,122 a hlavný vrchol OD vzoriek séra obsahujúcich anti-HBe bol v rozsahu od 2,431 do 3,231 (obrázok 1b).

Ryža. 1b. Distribúcia OD vzoriek séra obsahujúcich a neobsahujúcich anti-Hbuď, v testovacom systéme "DS-ELISA-anti-HBeAg»
Študovali sa vlastnosti distribúcie OD anti-HBe pozitívnych vzoriek.

sérum obsahujúce ( n=78) a neobsahujúce HBsAg ( n=56).


Ryža. 2a. HBe-pozitívne vzorky séra obsahujúceHBsAgv testovacom systéme "DS-ELISA-anti-HBe».

Obr.2b. Vlastnosti distribúcie OP anti-HBe-pozitívne vzorky séra, ktoré neobsahujú HBsAgv testovacom systéme "DS-ELISA-anti-HBe».
Optické hustoty 87 % vzoriek anti-HBe-pozitívneho séra, ktoré neobsahovali HBsAg, sa pohybovali od 0,41 do 0,81 (obrázok 2b). Súčasne len 14 % vzoriek anti-HBe-pozitívnych sér obsahujúcich HBsAg malo OD v tomto rozsahu (obrázok 2a). Je známe, že vo fáze neskorej rekonvalescencie s negatívnou reaktivitou na HBsAg dochádza k postupnému znižovaniu titrov protilátok proti HBeAg (obrázok 2b). Preto je možné, že prevládajúca koncentrácia anti-HBe-pozitívnych vzoriek zodpovedala OD menšej ako 0,8.

Získané údaje poukazujú na spoľahlivosť separácie pozitívnych a

negatívne vzorky krvného séra bez ohľadu na štádium ochorenia. Štúdia citlivosti a špecifickosti testovacích systémov "DS-ELISA-HBeAg" a "DS-ELISA-antiHBe" bola vykonaná v porovnaní s testom "Monolisa HBe" ("BIORAD", Francúzsko) (tabuľka 1).

stôl 1
Porovnávacie charakteristiky citlivosti a špecifickosti

testovacích systémov DS-ELISA-HBeAg a DS-ELISA-antiHB

Údaje uvedené v tabuľke 1 ukazujú 100 % zhodu medzi výsledkami.

Je známe, že kombinovaná indikácia HBeAg a anti-HBe, najmä ich kvantitatívne hodnotenie, má dodatočnú prognostickú hodnotu. Rýchly nárast titra anti-HBe charakterizuje aktívnu humorálnu imunitnú odpoveď a prakticky eliminuje hrozbu chronicity. Analyzovali sme zmenu obsahu HBeAg/anti-HBe vo vzorkách krvného séra pacientov s klinickou diagnózou akútnej vírusovej hepatitídy B (tabuľka 2).

tabuľka 2
Dynamika sérokonverzie HBeAg/anti-HBe u pacientov s akútnou hepatitídou B

* od prijatia do nemocnice
Všetky vzorky séra boli testované na prítomnosť sérologických markerov.

OGV: HBsAg, anti-HBc, anti-HBc IgM. Obdobie pozorovania sa pohybovalo od 13 do 38 dní. U pacientov č. 1, č. 2 a č. 6 bola anti-HBe zistená už na pozadí poklesu titra HBeAg. U pacientov č. 3 a č. 4 sa anti-HBe objavila po vymiznutí HBeAg z krvného séra na 21. a 8. deň. Analýza detekcie HBeAg v krvnom sére pacienta č. 5 pri prijatí do nemocnice ukázala negatívny výsledok. Zároveň bola zaznamenaná konverzia na anti-HBe už v prvý deň vyšetrenia.

Všetky subjekty vykazovali trend k zvýšeniu titra protilátok proti HBeAg v

krvné sérum, čo umožňuje predpovedať priaznivú dynamiku klinickej

prejavy OGV a rýchle zotavenie.

Štúdium nových testovacích systémov ukázalo ich vysokú diagnostickú spoľahlivosť. Výsledky porovnania DS-ELISA-HBeAg“ a „DS-ELISA-antiHBe“ preukázali 100% zhodu s testom „Monolisa HBe“.

Pri štúdiu vzoriek séra pacientov s hepatitídou B v dynamike, testy

potvrdila vysokú citlivosť a špecifickosť.

Krátky inkubačný čas testovaných vzoriek a konjugátu (1 h) umožňuje určiť správnu taktiku na vykonávanie terapeutických opatrení v čo najkratšom čase. Vytvorené testovacie systémy sú jednoduché na nastavenie, ekonomické (50 µl séra je potrebných na stanovenie HBeAg a 10 µl séra na stanovenie anti-HBe). Vysoká kvalita testov umožňuje ich úspešné využitie pri predpovedaní priebehu infekčného procesu a monitorovaní prebiehajúcej terapie hepatitídy B.
LITERATÚRA

1.Mayer K.P. Hepatitída a následky hepatitídy / K.P. Mayer.– M., GEOTAR, Medicína, 1999.- C.720

2.Oniščenko G.G.Šírenie vírusovej hepatitídy ako hrozba pre národnú bezpečnosť / G.G. Oniščenko, L.A. Dementieva // Journal of microbiology. –2003.-Č.4.- S.93-99.

3.Sorinson S.N. Vírusová hepatitída / S.N.Sorinson. - Petrohrad, Teza, 1997.- 306 s.

4. Baumeister M. Epitopy špecifické pre vírus e hepatitídy B a obmedzenia komerčných imunoanalýz anti-HBe / M. Baumeister // Journal of Medical Virology.- 2000.-N 60.- S.256-263.

5.Kane M. Globálny program na kontrolu infekcie hepatitídou B / M. Kane// Vaccine. - 1995.-N131(Suppl. 1).- R.47-6. Shunichi Soo. Kmene vírusu hepatitídy B s mutáciami v jadre promótora u pacientov s fulminantnou hepatitídou / Shunichi Sato, Kazuyuki Suzuki // Annals of Internal Medicine. - 1995.- N122.- R.241-248.

7. Ou J.-H. Molekulárna biológia e antigénu vírusu hepatitídy B./ J.-H.Ou // Journal of Gastroenterology and Hepatology. - 1997.- č. 12 (Suppl.1) - R. 178-187.

8.Tiollais P. Vírus hepatitídy B. / P.Tiollais, C.Pourcel, A.Dejean // Príroda. - 1985. - S.317, 489-495
Publikované: Zh. "Klinická laboratórna diagnostika" - 2005.-№6-S.-34-37

1 Nastavte priradenie

1.1 Súprava je určená na súčasnú detekciu protilátok proti vírusu ľudskej imunodeficiencie prvého a druhého typu (HIV-1 a HIV-2) a antigénu HIV-1 p24 v ľudskom sére a plazme „in vitro“ prostredníctvom nepriamych enzýmových- spojený imunosorbentový test.

2 Charakteristika a princíp činnosti súpravy

2.1 Zloženie sady:

2.2 Hlavnými zložkami súpravy "ELISA-HIV 1.2 AGAT" sú imunosorbent, roztok konjugátu č.1 a konjugát č.2.

Imunosorbent je polystyrénová tableta, v ktorej jamkách je adsorbovaná zmes rekombinantných antigénov HIV-1 (gp41) a HIV-2 (gp36) a monoklonálnych protilátok proti antigénu HIV-1 p24.

Roztok konjugátu #1 je zmes biotínom značených monoklonálnych ľudských protilátok proti HIV-1 p24 antigénu a biotínom značených rekombinantných HIV-1 a HIV-2 proteínov.

Konjugát #2 je streptavidín konjugovaný s chrenovou peroxidázou.

Pozitívna kontrolná vzorka AT- ľudské krvné sérum obsahujúce protilátky proti HIV-1 a HIV-2, neobsahujúce protilátky proti vírusu hepatitídy C a Treponema pallidum, HIV-1 p24 antigén a HBs antigén, inaktivované zahrievaním počas 3 hodín pri teplote 56 ºC.

Pozitívna kontrolná vzorka AG– ľudské krvné sérum obsahujúce natívny antigén p24 HIV-1, neobsahujúce protilátky proti HIV-1, HIV-2, vírusu hepatitídy C a Treponema pallidum a antigén HBs, inaktivované zahrievaním počas 3 hodín pri teplote 56 ºC.

Negatívna kontrolná vzorka– ľudské krvné sérum, ktoré neobsahuje protilátky proti HIV-1, HIV-2, HCV, HIV-1 p24 antigén a HBs antigén, inaktivované 3 hodinovým zahrievaním pri teplote 56 ºC.

Princíp fungovania súpravy. Keď sa do jamiek tablety pridá roztok konjugátu č. 1 a vzorky séra infikovanej krvi, antigén p24 sa viaže na špecifické protilátky na pevnej fáze a na monoklonálne biotinylované protilátky proti p24, ktoré sú súčasťou roztoku konjugátu. č. 1; HIV-špecifické protilátky sa viažu ako na rekombinantné antigény HIV-1 a HIV-2 adsorbované na pevnej fáze, tak aj na antigény obsiahnuté v roztoku konjugátu č. 1, pričom vytvárajú komplexy antigén-protilátka. Imunitné komplexy anti-p24 špecifických protilátok a p24 antigénu sú detegované konjugátom č.2. Po umytí nenaviazaných zložiek sa do jamiek doštičky pridá roztok peroxidázového substrátu (peroxid vodíka) a TMB chromogénu.

Reakcia peroxidázy sa zastaví pridaním zastavovacieho činidla (0,9 M roztok kyseliny sírovej) a intenzita farby roztoku v jamkách sa meria na spektrofotometri ako hodnota optickej hustoty (OD) pri vlnovej dĺžke 450 nm.

Hodnota OD je priamo úmerná koncentrácii špecifických protilátok a/alebo antigénu p24 vo vzorke séra alebo plazmy. Čím vyšší je obsah protilátok a/alebo antigénu p24 vo vzorke séra, tým vyššia je intenzita farbenia.

2.3 Súprava je navrhnutá tak, aby držala 24 inscenácií ELISA: 1 nastavenie - 1 prúžok (8 otvorov). Celkom - 192 definície vrátane kontrolných vzoriek.

3 Preventívne opatrenia pri používaní súpravy

3.1 Všetky zložky súpravy v použitých koncentráciách sú netoxické. Pracujte však so všetkými testovanými vzorkami ľudského séra (plazmy), ktoré by sa mali považovať za potenciálne infikované, schopné uchovávať a prenášať HIV, vírus hepatitídy B alebo akýkoľvek iný patogén vírusovej infekcie, s použitými roztokmi a tekutinami, rôznymi zariadeniami, ktoré môže byť kontaminovaný v procese analýzy vyžaduje určité bezpečnostné opatrenia pri používaní súpravy:

Práca sa musí vykonávať v špeciálne vybavenej miestnosti;

Je potrebné pracovať s použitím osobných ochranných prostriedkov a s dodržiavaním opatrení v súlade s požiadavkami , , a .

3.2 Stop činidlo obsahujúce kyselinu sírovú je dráždivé. V prípade kontaktu s pokožkou a sliznicami ihneď opláchnite veľkým množstvom vody.

3.3 Pri práci so súpravou musia byť pracoviská vybavené prívodným a odsávacím vetraním.

3.4 Všetky osoby pracujúce v laboratóriu so súpravami sa musia podrobiť povinnej lekárskej prehliadke v súlade s požiadavkami.

3.5 Zdravotnícky odpad a/alebo nepoužité súpravy s exspirovanou dobou použiteľnosti musia byť riadne zlikvidované.

4 Pravidlá pre prácu so zostavou

4.1 Aby sa vylúčili falošné výsledky, testovacie vzorky sa musia pripraviť a skladovať za podmienok, ktoré bránia rastu baktérií. Vzorky séra obsahujúce agregované zložky séra alebo sediment by mali byť vyčistené centrifugáciou počas (5-10) minút pri 3000 ot./min. Vzorky séra možno skladovať pri teplote (2-8) °C maximálne 5 dní. Zmrazené vzorky (najlepšie na teplotu najmenej mínus 20 °C) možno skladovať najviac 1 rok. Je potrebné vyhnúť sa opakovaným cyklom zmrazovania a rozmrazovania vzoriek.

Je potrebné mať na pamäti, že vzorky s hemolýzou, hyperlipidémiou, rastom baktérií, ako aj vzorky skladované dlhší čas bez zmrazenia nie sú vhodné na analýzu.

Spoľahlivosť výsledkov závisí od nasledujúcich pravidiel:

Nie je dovolené používať súpravu po dátume exspirácie, ako aj miešať zložky súprav z rôznych sérií;

Na prípravu každého činidla by sa mala použiť samostatná nádoba;

Všetky nádoby používané na prípravu činidiel neošetrujte dezinfekčnými a čistiacimi prostriedkami. V prípade potreby opláchnite pitnou vodou a potom päťkrát opláchnite destilovanou vodou;

Na prácu s chromogénom TMB a RX je potrebné použiť samostatné nádoby na roztoky, špičky pipiet a misky.

Je potrebné dbať na dôkladné premiešanie činidiel;

Čas medzi naplnením a vyprázdnením jamiek doštičky roztokmi a činidlami by mal byť aspoň 30 sekúnd. Nie je dovolené sušiť jamky vo všetkých fázach nastavenia ELISA;

Pri používaní podložky sledujte stav nádoby na roztok na umývanie dosky a spojovacích hadíc: nemali by vykazovať známky rastu baktérií alebo húb;

Je potrebné používať automatické pipety s vymeniteľnými špičkami, certifikované hodnotou priemernej dávky a konvergenciou výsledkov pipetovania (chyba nie väčšia ako 3%);

Dávkovače a pracovné plochy by mali byť ošetrené roztokom s objemovým podielom etylalkoholu 70%. Nepoužívajte chlóramín a iné látky obsahujúce chlór;

Na manipuláciu s testovacími a kontrolnými vzorkami sa odporúča používať jednorazové pipetové špičky. Každá vzorka séra, ako aj reagencie súpravy, sa musia odoberať samostatnou špičkou.

Pri zavádzaní PK-1 do jamiek sa špičkou pipety nedotýkajte povrchu tablety a roztoku v jamkách.

Počas analýzy sa vyhýbajte priamemu slnečnému žiareniu na pracovnej ploche.

4.2 Pri otváraní a rozpúšťaní lyofilizovaných zložiek je potrebné zabezpečiť, aby na viečku a stenách liekoviek nezostala žiadna sušina.

5 Vybavenie a materiály potrebné na analýzu

5.1 Vertikálny skenovací spektrofotometer, ktorý umožňuje meranie optickej hustoty roztokov v jamkách tablety pri vlnovej dĺžke 450 nm;

Poloautomatické alebo automatické zariadenie na umývanie tabliet (umývačka);

Termostat suchého vzduchu typu TC-80 M2, udržiavajúci teplotu (37 ± 1) °C alebo podobné charakteristiky;

Jednokanálové automatické pipety s vymeniteľnými špičkami, ktoré umožňujú odoberať objemy kvapaliny od 0,01 do 5,0 ml;

Pipety 8-kanálové automatické s vymeniteľnými hrotmi, umožňujúce výber objemu kvapaliny až do 0,5 ml;

Odmerný valec s objemom 2000 ml;

Laboratórna banka s objemom 2000 ml;

Sklenené fľaše s objemom 20 ml;

Podnosy na činidlá alebo Petriho misky (priemer 100 mm);

Lekárska vata hygroskopická;

Filtračný papier;

Gumové chirurgické rukavice;

Roztok s objemovým podielom etylalkoholu 70%;

Roztok s hmotnostným zlomkom peroxidu vodíka 6%;

Deionizovaná alebo destilovaná voda;

Nádoba na zber pevného odpadu;

Nádoba na odtok tekutého odpadu.

6 Príprava na analýzu

6.1 Pred analýzou vyberte reagenčnú súpravu z chladničky, otvorte veko škatule a komponenty súpravy uchovávajte pri teplote (18-25) °C počas 30 min.

Všetky vzorky séra (plazmy) a reagencie pred analýzou dôkladne premiešajte.

Spotreba činidla testovacej súpravy, ktorá je určená počtom použitých prúžkov, je uvedená v tabuľke A.1 v prílohe A.

6.2 Príprava roztoku na premývanie doštičiek

Pozor! Pripravte roztok na umývanie platne 15 minút pred začiatkom analýzy!

Ak injekčná liekovka s FSB-T × 25 obsahuje zrazeninu, musí sa pred použitím zahriať na teplotu (37 ± 1) °C, kým sa zrazenina úplne nerozpustí. Do odmerného valca s objemom 2000 ml pridajte obsah liekovky s FSB-T × 25, potom pridajte destilovanú vodu po značku 1250 ml a jemne premiešajte roztok. Roztok sa môže skladovať pri (2-8) °C počas 72 hodín.

V prípade použitia jedného alebo viacerých prúžkov dôkladne pretrepte obsah liekovky s FSB-T × 25 (20-30) s, odoberte požadovaný objem roztoku (tabuľka A.1) do odmerky alebo valca pridajte potrebné množstvo destilovanej vody a roztok premiešajte. Nepoužitý FSB-T×25 je možné skladovať v uzavretej liekovke pri teplote (2-8) °C počas dátumu exspirácie súpravy.

6.3 Imunosorbentový prípravok

Imunosorbent je pripravený na použitie.

Otvorte balenie a nainštalujte požadovaný počet pásikov na rám. Zvyšné prúžky skladujte v tesne uzavretom vrecku s vysúšadlom pri (2-8) °C počas 3 mesiacov.

6.4 Príprava K + AT, K - , RK-1, PP-K2, BRS a zastavovacieho činidla

K + AT, K - , RK-1, RR-K2, BRS a stop činidlo sú pripravené na použitie.

Pozor! Zrážanie je možné v liekovke s RK-1. Na analýzu sa musí použiť supernatant.

Nepoužité RK-1, PP-K2, BRS a zastavovacie činidlo po otvorení liekoviek možno skladovať v uzavretých liekovkách pri teplote (2-8) °C počas dátumu exspirácie súpravy.

Zvyšok K + AT a K - po otvorení fľaštičky je možné skladovať v uzavretých fľašiach pri teplote (2-8)°C počas dátumu exspirácie súpravy.

6.5 Príprava roztoku K + AG

Pozor! Roztok K + AG je potrebné pripraviť 15 minút pred začiatkom analýzy!

Na obnovenie lyofilizovaného K + AG pred otvorením injekčnej liekovky ľahkým poklepaním vytraste častice prilepené na stenách liekovky alebo zátky. Otvorte injekčnú liekovku a položte korok hore dnom na suchý povrch. Pridajte 0,8 ml destilovanej vody do liekovky. Injekčnú liekovku uzavrite zátkou, podržte ju 10 minút pri teplote (18-25) °C a jemne nakláňajte a otáčajte liekovku, miešajte jej obsah, kým sa úplne nerozpustí, aby sa zabránilo tvorbe peny.

Rekonštituovaný K + AG sa môže uchovávať v uzavretej injekčnej liekovke pri teplote (2-8) ° C počas jedného mesiaca, pri teplote mínus 20 ° C - počas šiestich mesiacov. Jednorazové zmrazenie a rozmrazenie obnoveného K + AG je povolené.

6.6 Príprava roztoku Kg-2 v pracovnom riedení

Z liekovky s kg-2 odoberte objem uvedený v tabuľke A.1 a preneste ho do liekovky s PP-K2. Obsah injekčnej liekovky dôkladne premiešajte, aby ste zabránili tvorbe peny.

Ak použijete jeden alebo viac prúžkov, odoberte požadované množstvo PP-K2 do čistej injekčnej liekovky, pridajte kg-2 podľa tabuľky A.1 a roztok premiešajte bez penenia.

Pozor! Kg-2 roztok v pracovnom riedení sa pripravuje bezprostredne pred použitím! Kg-2 roztok v pracovnom zriedení možno skladovať 15 minút pri teplote (18-25) °C. Používajte len nový zásobník na činidlo a nové hroty!

Zvyšok Kg-2 možno skladovať v uzavretej liekovke pri teplote (2-8) °C počas dátumu exspirácie súpravy.

6.7 Príprava roztoku pracovného substrátu

Fľaša s TMB chromogénom sa musí pred použitím zahriať na teplotu (37±1)° C až do úplného rozpustenia kryštálov.

Odoberte objem uvedený v tabuľke A.1 z liekovky s TMB chromogénom a preneste ho do liekovky s BRS. Obsah injekčnej liekovky dôkladne premiešajte, aby ste zabránili tvorbe peny.

Ak použijete jeden alebo viac prúžkov, odoberte požadované množstvo BRS do čistej liekovky, pridajte TMB chromogén podľa tabuľky A.1 a roztok premiešajte bez penenia.

Pozor! Pracovný roztok podkladu sa pripravuje bezprostredne pred použitím na mieste chránenom pred svetlom! Roztok sa môže uchovávať 20 minút pri teplote (18-25) °C, chránený pred svetlom.

Roztok musí byť chránený pred svetlom a kontaktom s kovmi alebo kovovými iónmi. Substrátový roztok musí byť pred použitím bezfarebný. Riad, ktorý bude počas reakcie v kontakte s roztokom substrátu, by sa mal umývať bez použitia syntetických čistiacich prostriedkov. Používajte len nový zásobník na činidlo a nové hroty!

Zvyšok TMB chromogénu je možné skladovať v uzavretej liekovke pri teplote (2-8) °C počas dátumu exspirácie súpravy.

7 Požiadavky na umývanie tanierov

Vo všetkých fázach umývania je potrebné kontrolovať plnenie všetkých jamiek a úplné odstránenie (odsávanie) kvapaliny z nich;

Pri každom premývaní je potrebné naplniť všetky jamky roztokom až po okraj (0,30-0,35 ml na jamku), bez pretečenia a pretečenia kvapaliny zo susedných jamiek;

Udržujte jamky naplnené roztokom na premývanie doštičiek počas 30 s;

Pri každom nasatí opatrne odstráňte zvyšnú kvapalinu z jamiek poklepaním na rám s prúžkami v obrátenej polohe na niekoľkokrát prehnutom filtračnom papieri umiestnenom na fólii polyetylénu;

Nedostatočné umytie taniera vedie k nesprávnym výsledkom.

8 Vykonávanie analýzy

8.1 Do dvoch ľubovoľných jamiek tablety pridajte 0,07 ml(70 µl) K + AT, v ďalších dvoch studniach - tým 0,07 ml(70 µl) K + AG, v troch ďalších jamkách - podľa 0,07 ml(70 µl) TO - .

Pozor! Pri nastavovaní ELISA na jednom prúžku je dovolené použiť dve jamky pre K - - jednu jamku, pre K + AT - jednu jamku, pre K + AG - jednu jamku.

Do zvyšných jamiek tablety pridajte 0,07 ml(70 µl) študovaných vzoriek ľudského séra (plazmy).

Pozor! Každá vzorka musí byť odobratá jednorazovou špičkou!

8.2 Do všetkých jamiek tablety cez kontrolné vzorky a testovacie vzorky krvného séra (plazmy) hneď prispieť tým 0,05 ml(50 µl) RK-1. Obsah jamiek premiešajte jemným poklepaním na okraje platne.

8.3 (37 ± 1) ° zvnútra 60 min.

Pozor! Na (1-2) minúty pred koncom inkubácie pripravte roztok Kr-2 v pracovnom riedení (časť 6.6).

8.4 Odstráňte obsah jamiek pomocou premývačky, potom premyte jamky na platni premývacím roztokom (krok 6.2). sedemkrát.

8.5 Pridajte do všetkých jamiek platne 0,15 ml(150 ul) roztoku Kg-2 v pracovnom chove (odsek 6.6).

8.6 Platničku uzavrite fóliou alebo prikryte viečkom a inkubujte v termostate pri teplote (37 ± 1) ° zvnútra 10 minút.

8.7 Odstráňte obsah jamiek platne premývačkou, potom premyte jamky platní roztokom na umývanie platne (časť 6.2). sedemkrát.

8.8 Zaveďte do všetkých jamiek tablety 0,15 ml(150 µl) pracovný roztok substrátu(odsek 6.7).

Pri príprave pracovného roztoku substrátu (bod 6.7) f lakon s TMB chromogénom sa musí pred použitím zahriať (3-5) minút pri teplote (37± 1) °C, kým sa kryštály úplne nerozpustia.

8.9 Platničku uzavrite fóliou alebo prikryte viečkom a inkubujte v termostate pri teplote (37 ± 1) ° S na tmavom mieste pre 15 minút.

Pozor! Na konci inkubácie v jamkách so vzorkami séra obsahujúcimi protilátky proti HIV-1 a/alebo HIV-2 a/alebo HIV-1 p24 antigénu sa farba roztoku zmení z bezfarebnej na modrú s rôznou intenzitou v závislosti od koncentrácie protilátky a/alebo antigén vo vzorke testovaného séra.

8.10 Zastavte peroxidázovú reakciu pridaním do všetkých jamiek 0,05 ml(50 µl) zastaviť činidlo.

Pozor! Jamky so vzorkami séra obsahujúcimi protilátky proti HIV-1 a/alebo HIV-2 a/alebo HIV-1 p24 antigénu zmenia farbu roztoku z modrej na žltú s rôznou intenzitou.

8.11 Najneskôr (1-2) minúty po zastavení reakcie stanovte OD v jamkách v režime jednej vlny pri vlnovej dĺžke 450 nm.

9 Spracovanie výsledkov analýzy

9.2 Výsledky sa berú do úvahy iba vtedy, ak:

Hodnota OPsr K - nepresahuje 0,2 OE;

Každá jednotlivá hodnota OP K - by sa nemala odchyľovať od OP K - viac ako 30%. Ak jedna z troch hodnôt OP K - prekročí túto hranicu, mala by byť z výpočtu OP K - vylúčená. Ak sú dve z troch hodnôt ODK mimo tohto limitu, test by sa mal zopakovať s novou sadou činidiel;

Hodnota OPsr K + AT viac ako 1,0 OE;

Hodnota OPsr K + AG je viac ako 1,0 OE.

9.3 Ak sú splnené vyššie uvedené podmienky, vypočítajte kritickú hodnotu (OPcrit.), OE, podľa vzorca (1):

OPcrit. = OPsr K - + 0,14 (1).

10 Analytické a diagnostické charakteristiky

Citlivosť reagenčná súprava ELISA-HIV 1,2 AGAT na detekciu HIV-1 p24 antigénu –

Špecifickosť reagenčná súprava ELISA-HIV 1,2 AGAT– 100% štandardná AT(-)HIV. Štandardný panel sér, ktoré neobsahujú protilátky proti vírusu ľudskej imunodeficiencie prvého a druhého typu (HIV-1,2) a antigén HIV-1 (p24). CJSC MBS.

11 Formulár na uvoľnenie súpravy

11.1 Sada je dostupná v piatich konfiguráciách:

1 sada 1P - manuálna analýza. Súprava je určená pre 12 sérií ELISA na skladacej platni: 1 séria - 1 prúžok (8 otvorov). Celkovo - 96 stanovení vrátane kontrolných vzoriek;

2 sady 2M - manuálna analýza. Súprava je určená pre 2 testy ELISA na monolitických platniach: 1 cyklus - 1 platňa. Celkom - 192 stanovení vrátane kontrolných vzoriek;

3 nastaviť 2P- manuálna analýza. Súprava je navrhnutá tak, aby držala 24 inscenácií ELISA pre 2 skladacie x tablety: 1 nastavenie - 1 prúžok (8 otvorov). Celkom - 192 definícií vrátane kontrolných vzoriek;

4 sada A2M - analýza na automatickom analyzátore. Súprava je určená pre 2 testy ELISA na monolitických platniach: 1 cyklus - 1 platňa. Celkom - 192 stanovení vrátane kontrolných vzoriek;

5 set A2P - analýza na automatickom analyzátore. Súprava je určená pre 24 cyklov ELISA na 2 skladacích platniach: 1 cyklus - 1 prúžok (8 otvorov). Spolu 192 stanovení vrátane kontrolných vzoriek.

12 Podmienky skladovania a používania súpravy

12.1 Súprava by sa mala skladovať v čistej miestnosti chránenej pred vlhkosťou a svetlom pri teplote (2-8) °C počas celej doby použiteľnosti. Komponenty súpravy nezmrazujte.

12.2 Na získanie spoľahlivých výsledkov je potrebné prísne dodržiavať návod na použitie súpravy.

12.3 Dátum exspirácie súpravy 12 mesiacov.

Príloha A

Tabuľka A.1 - Spotreba činidiel súpravy ELISA

Bibliografia