Ako imunološki enzimski test nije potvrdio HIV. ELISA je pouzdana metoda za dijagnosticiranje HIV-a. Kako i gdje polagati IFA. Kako uzeti analizu

Infekcija virusom ljudske imunodeficijencije ozbiljna je dijagnoza. Pogreške u dijagnozi mogu dovesti do katastrofalnih posljedica. ELISA analiza na HIV je najpristupačnija metoda istraživanja, ali nije informativna u svim slučajevima.

ELISA - enzimski imunotest. Zadatak metode ELISA je otkrivanje protutijela na virus imunodeficijencije u biološkom materijalu. Korištenjem metode moguće je pratiti prisutnost u tekućini ne samih virusa, već samo antitijela proizvedenih kao odgovor na njihovu prisutnost. ELISA se široko koristi u dijagnostici spolno prenosivih bolesti. Pomaže u prepoznavanju spolno prenosivih bolesti.

Postoji nekoliko vrsta ELISA: izravna varijanta, neizravna varijanta, sendvič metoda. U svakom slučaju, tehnika se temelji na određivanju prisutnosti antitijela, koja služe kao pokazatelj prodiranja stranog agensa. Da bi se otkrile te "obilježe", biološka komponenta se tretira enzimima.

ELISA otkriva antitijela s točnošću od 96 - 98%, greška je zanemariva. To je 2-4%.

ELISA - metoda za dijagnosticiranje HIV-a

ELISA analiza na HIV je prva faza dijagnoze. Antigeni virusa imunodeficijencije su proteini p24, p15, p17, p31 i glikoproteini gp 41, gp55, gp66, gp120, gp160.

Da bi se otkrio virusni protein, dio krvi se uzima iz vene. Uzorak poslan na ELISA ispitivanje krvi tretira se reagensima za enzimski imunotest. Serum je izoliran iz krvi. Ako se tijekom studije pronađu, virus je već prisutan u krvi.

Krv se daje strogo na prazan želudac. 2 dana prije analize ne preporuča se jesti masnu hranu i piti alkohol. Trebali biste prestati uzimati antivirusne lijekove u roku od 14 dana.

Prednosti metode:

• relativno niska cijena;
• visoka stabilnost reagensa;
• visoka osjetljivost;
• kratko vrijeme isporuke;
• minimalan utjecaj ljudskog faktora.

Suvremeni testni sustavi za ELISA proizvode se prema svjetskim standardima. Time se poboljšava točnost metode.

ELISA ne daje uvijek pouzdane rezultate. Nakon što virus uđe u krv, počinje latentna (skrivena) faza razvoja. Razdoblje dok se virusi ne počnu razmnožavati, a antitijela se još nisu stvorila naziva se “seronegativni prozor”. U ovoj fazi je besmisleno raditi ELISA. Ako je došlo do infekcije, rezultat će biti . Koliko će se virus brzo otkriti ovisi o tome koliko je opasnih stanica ušlo u tijelo. Kod nezaštićenog snošaja ili transfuzije zaražene krvi to će razdoblje biti minimalno.

Za visoku pouzdanost ELISA za HIV, studija se provodi tri puta. Rokovi za ELISA test na virus ljudske imunodeficijencije:

• 6 tjedana nakon vjerojatnog kontakta,
• za 3 mjeseca,
• šest mjeseci kasnije.

ELISA 4. generacije za HIV je najinformativnija metoda u ranim fazama infekcije. Može se provesti već 1 mjesec nakon navodne infekcije. Test je skup u odnosu na pandan 3. generacije. Stoga se u javnim zdravstvenim ustanovama koristi kao dodatna dijagnostička metoda. Besplatno se provodi test 3. Ako na temelju njegovih rezultata nije moguće dati jednoznačan odgovor, pacijent se šalje na ELISA 4. generaciju.

Važno! Neposredno nakon infekcije, osoba postaje zarazna. Opasan je za druge, čak i kada još ne zna za svoju dijagnozu!

Ako se tijekom ELISA-e otkriju antitijela na antigene HIV-a, potrebne su dodatne studije. Spada u ove. Pouzdanost ove metode je 80%. Uz pomoć PCR-a, ispituje se krv, sperma i vaginalni iscjedak. Biološka tekućina se cijepa u medicinskom reaktoru, a zatim se podvrgava enzimskom tretmanu. Kao rezultat, dobivaju se podaci o koncentraciji HIV stanica u tekućem mediju. Zbog velike pogreške (20%), uz pozitivan rezultat, dodatno se provodi imunoblotiranje.

Sljedeći dijagnostički korak je Combo test (ili imunološki bloting). Ovo je vrlo osjetljiva studija (98% pouzdanosti) i treba je učiniti ako rezultati ELISA-e nisu uvjerljivi nakon 6 mjeseci.

Tumačenje rezultata ELISA

Vrijeme dešifriranja je od 24 do 48 sati. Ako je potrebno hitno dobiti informacije (potrebna je kirurška intervencija), dekodiranje se provodi za 2 sata. Pokrajinske medicinske stanice nemaju uvijek potrebne reagense. Uzorak se uzima na mjestu prometa, a zatim se prenosi u regionalni centar. U takvim okolnostima, rezultat se može saznati za 1-2 tjedna.

Rezultat enzimskog imunološkog testa može biti pozitivan ili negativan; nema drugih opcija.

Čak i ako je rezultat bio pozitivan tijekom primarne i ponovljene ELISA-e, pacijent se ne može prepoznati kao zaražen HIV-om. Moguća pogreška. Razlozi za lažno pozitivan rezultat:

• kronična bolest;
• dugotrajne zarazne bolesti;
• trudnoća.

Stoga bi rezultat analize trebao biti razjašnjen dodatnim studijama.

Ako se tijekom imunoblotinga na HIV (reaktivan), osoba smatra HIV-om zaraženom, što znači da je zdrava.

Stanice virusa se s vremenom prilagođavaju propisanim lijekovima. Za kontrolu, ELISA test se povremeno ponavlja.

Ponekad imunobloting pokazuje lažno negativan rezultat. Izuzetno rijedak virus imunodeficijencije 6 mjeseci (ili više). To je moguće ako je mala količina virusnih stanica ušla u krvotok. U 0,5% od ukupnog broja slučajeva infekcija se može dijagnosticirati tek nakon godinu dana. U 99,5%, unutar šest mjeseci nakon infekcije, ELISA će dati pouzdan rezultat.

Čak i uz visokoprecizne studije, još uvijek postoji granica pogreške od 2%. Ne treba zaboraviti ni ljudski faktor. Kako bi se otklonila mogućnost pogreške, test se može provesti u 2 različite ustanove.

Za provođenje sveobuhvatne procjene stanja tijela koristi se dijagnostička metoda ELISA. ELISA krvni test je dizajniran za dijagnosticiranje infektivnih, hematoloških, primarnih i sekundarnih imunodeficijencija.

Što je ELISA analiza

Mnogi pacijenti su zainteresirani za ELISA metodu: što je to, čemu služi studija. Enzimski imunotest se koristi relativno nedavno. U početku se koristio za proučavanje antigenskih struktura, a provodio se samo u znanstvene svrhe. Tada su znanstvenici došli do zaključka da je uz pomoć enzima moguće identificirati specifična antitijela koja nastaju kao odgovor na bolest koja je u tijeku.

U početku su ovu tehniku ​​koristile samo medicinske ustanove uskog profila, uglavnom na postajama za transfuziju krvi. Od posebne je važnosti ELISA metoda za otkrivanje HIV infekcije.

Danas ova metoda ima širok opseg primjene. Moderni laboratoriji ga koriste za dijagnosticiranje:

• tumori;
• hormonalni poremećaji;
• infekcije;
• kronični ili prethodno preneseni zarazni procesi;
• helminti.

Ako se u tijelu pojavi zarazni proces, tada se ova vrsta dijagnoze smatra najoptimalnijom za određivanje vrste bolesti.

Bit metode i njezine vrste

ELISA metoda - što je to, koja je bit ove vrste istraživanja? Ovo i mnoga druga pitanja zanimaju pacijente. Temelj ove dijagnostičke metode je vezanje imunoloških stanica tijela na antigene infektivnih agenasa. Dobiveni kompleks se određuje pomoću posebnog enzima.

Da biste razumjeli princip ELISA metode, morate znati kako se odvija reakcija antigen-antitijelo. Antigen je proteinska molekula strana tijelu koja ulazi zajedno s infekcijom. Čestice strane krvi koje se ne podudaraju u skupini također se smatraju antigenima. U tijelu izazivaju imunološki odgovor usmjeren na zaštitu od stranih tvari. Stoga ljudsko tijelo proizvodi antitijela - imunoglobuline koji se mogu vezati za antigene, tvoreći imunološki kompleks. Takve spojeve imunološke stanice puno lakše prepoznaju i uništavaju.

Reakcija na prisutnost takvih imunoloških kompleksa provodi se u laboratoriju, koristeći gotove spojeve kako bi se utvrdilo ima li sličnih u krvi.

Bit metode ELISA prilično je jednostavna, međutim, zbog činjenice da se krvni test provodi za otkrivanje mnogih infekcija i bolesti, postoji nekoliko njegovih sorti. Svaki se razlikuje po shemi ponašanja i opsegu. Može biti izravna ili neizravna ELISA. Izravna metoda podrazumijeva da se koriste imobilizirana antitijela koja reagiraju s antigenima. Glavna prednost ove metode je što se svi procesi mogu automatizirati, što znači da dijagnostika traje malo vremena.

Neizravna metoda podrazumijeva korištenje sekundarnih protutijela. A na čvrstoj fazi antigen je imobiliziran. Analiza vam omogućuje određivanje antitijela na različite antigene. To pomaže u postizanju točnijeg rezultata, ali metoda je složena.

Prednosti studija

ELISA metoda ima mnoge prednosti u odnosu na druge dijagnostičke metode. Glavne uključuju:

• visoka osjetljivost;
• stabilnost tijekom skladištenja sastojaka;
• brzina dijagnostike;
• može se koristiti mala količina ispitnog materijala;
• moguće je automatizirati sve procese;
• infekcija se može otkriti u ranoj fazi.

Ova dijagnostička metoda je univerzalna, stoga je prikladna za masovni pregled. Uz pomoć analize moguće je pratiti dinamiku tijeka zaraznog procesa.

Indikacije za analizu i uzorkovanje materijala

Provođenje studije ELISA metodom može se propisati ako postoji sumnja na razne bolesti:

Venska krv se ispituje na prisutnost antitijela. Prije analize iz nje se izoliraju elementi koji mogu zakomplicirati studiju. Mogu se uzorkovati i druge biološke tekućine.

Kako bi se dobile najtočnije informacije, vađenje krvi se provodi natašte. Ako je postupak propisan za određivanje latentne infekcije, nekoliko tjedana prije analize trebate prestati uzimati antibakterijske i antivirusne lijekove. Ovisno o opremljenosti laboratorija u kojem je uzet materijal, rezultat se može dobiti u roku od jednog dana. U hitnim slučajevima to se vrijeme smanjuje na nekoliko sati.

Analiza za sifilis

Korištenje ELISA metode pomaže u određivanju prisutnosti mnogih infekcija u tijelu, posebice sifilisa. Za ispitivanje se krv uzima iz vene na prazan želudac. Zatim se provodi studija koja pomaže utvrditi ne samo prisutnost bolesti u tijelu, već i točno vrijeme njezina početka, budući da se tijekom bolesti neka antitijela zamjenjuju drugima u strogo definiranom redoslijedu.

U akutnoj fazi, što ukazuje na produženi tijek bolesti, ili tijekom pogoršanja kronične infekcije, u krvi će se otkriti imunoglobulini tipa M. Prisutnost imunoglobulina tipa A ukazuje da infekcija živi u tijelu duže od 4 godine. tjedni. Imunoglobulini skupine G ukazuju na visinu bolesti ili prethodnu terapiju.

Prema stupnju boje jažica, procjenjuje se intenzitet tijeka zaraznog procesa, budući da njegova zasićenost ovisi o broju formiranih imunoloških kompleksa.

HIV test

ELISA metoda se također koristi za analizu jer u ovom slučaju ima određene značajke koje su povezane s tijekom i napredovanjem bolesti. Ova se metoda istraživanja smatra najprihvatljivijom za određivanje, međutim, treba je provesti najkasnije mjesec dana nakon izlaganja čimbenicima rizika. To je zbog prisutnosti razdoblja inkubacije koje traje od 45 dana do 6 mjeseci. Zato se analiza mora ponoviti nakon šest mjeseci.

• ascariasis;
• giardijaza;
• toksoplazmoza itd.

Unatoč svim prednostima, postoje i nedostaci ELISA metode. Glavni nedostatak je da prilikom provođenja studije liječnik mora unaprijed imati pretpostavku o bolesti.

Kada ne postoji način da se slučajno pronađe patogen i odredi njegova svojstva imunotestiranja enzima. Test samo ukazuje na prisutnost antitijela u krvi pacijenta. Osim toga, ovo je prilično skupa analiza.

Dešifriranje analize

Rezultat kvalitativne ELISA-e bit će ili prisutnost antitijela ili njihova odsutnost u krvi. Ako se provodi kvantitativna analiza, tada se koncentracija antitijela može izraziti bilo u brojčanoj vrijednosti ili u određenom broju znakova +.

Osim toga, pokazatelji kao što su:

Pokazatelj IgM ukazuje na tijek akutnog zaraznog procesa u tijelu. Njegova potpuna odsutnost može ukazivati ​​na odsutnost uzročnika bolesti ili njezin prijelaz u kronični stadij.

Očitavanje IgA s negativnim IgM testom ukazuje na kroničnu ili latentnu infekciju. Istodobna prisutnost IgM i IgA ukazuje da je bolest u akutnoj fazi. Prisutnost IgG ukazuje na prijelaz bolesti u kronični stadij ili potpuni oporavak i razvoj imuniteta.

Sada postoje posebni ELISA testovi koje možete napraviti sami.

ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA - engleski) ušla je u život praktične medicine negdje drugdje 60-ih godina prošlog stoljeća. Njegov početni zadatak bilo je histološko istraživanje u znanstvene svrhe, koje je bilo ograničeno na pretragu i identifikaciju antigenske strukture stanica živog organizma.

ELISA metoda temelji se na interakciji specifičnih (AT) i srodnih antigena (AG) s stvaranjem kompleksa antigen-antitijelo, što se detektira pomoću enzima. Ova činjenica navela je znanstvenike na ideju da se metoda može koristiti u dijagnostičke svrhe za identifikaciju specifičnih imunoglobulina različitih klasa uključenih u imunološki odgovor na određenu infekciju. I to je bio iskorak u kliničkoj laboratorijskoj dijagnostici!

Metoda se počela aktivno koristiti tek početkom 80-ih, a zatim uglavnom u specijaliziranim ustanovama. Centri i stanice za transfuziju krvi, zarazne i venerološke bolnice snabdjeveni su prvim imunoenzimskim analizatorima, budući da se s nama na pomolu pojavila strašna AIDS rođena na afričkom kontinentu i odmah pridružila "starim" infekcijama, zahtijevala je hitne mjere za dijagnosticiranje i traženje terapijskih lijekova koji utječu na njega.

Opseg ELISA metode

Mogućnosti enzimskog imunotestiranja uistinu su opsežne. Sada je teško zamisliti kako se može bez takvih studija, koje se koriste doslovno u svim granama medicine. Čini se da ELISA može učiniti u onkologiji? Ispostavilo se da može. I puno toga. Sposobnost analize da se pronađu markeri karakteristični za određene vrste malignih novotvorina temelj je ranog otkrivanja tumora, kada zbog male veličine još nije otkriven drugim metodama.

Suvremena klinička laboratorijska dijagnostika (CDL), osim tumorskih biljega, posjeduje značajan arsenal panela za ELISA test i pomoću njih dijagnosticira različita patološka stanja (infektivni procesi, hormonski poremećaji) i prati farmaceutske lijekove kako bi se utvrdio njihov učinak na bolesnikov tijelo i, usput rečeno, ne samo ljudsko. Trenutno se u veterinarskoj službi široko koristi enzimski imunotest, jer su i "naša manja braća" podložna mnogim bolestima od kojih ponekad i jako pate.

Tako, ELISA, zbog svoje osjetljivosti i specifičnosti, može odrediti iz uzorka krvi uzetog iz vene:

• Hormonski status (hormoni štitnjače i nadbubrežne žlijezde, spolni hormoni);
• Prisutnost virusne i bakterijske infekcije (HIV, B i C, klamidija, sifilis, i, kao i mnoge druge bolesti uzrokovane patogenim mikroorganizmima);
• Tragovi vitalne aktivnosti mikroorganizama koji su pokrenuli zarazni proces, koji je uspješno završio i prešao u fazu formiranja imunološkog odgovora na ovaj patogen. Takvi tragovi, odnosno antitijela, u mnogim slučajevima ostaju doživotno cirkulirati u krvi, što čovjeka štiti od ponovne infekcije.

Koja je bit IF?

Metoda imunološke enzimske analize omogućuje određivanje ne samo prisutnosti samog patogena (kvalitativna analiza), već i njegovog kvantitativnog sadržaja u krvnom serumu pacijenta.

Virusna ili bakterijska doza značajno utječe na tijek infektivnog procesa i njegov ishod, pa kvantitativna analiza ima važnu ulogu u dijagnostici i liječenju bolesti u različitim oblicima i stadijima.

Međutim, poznavajući enzimske imunosorbentne analize kao ELISA metodu, uopće ne razmišljamo o tome kako ona uspijeva pokriti tako širok raspon mikroorganizama koji nastanjuju naš planet, od kojih mnogi predstavljaju izravnu prijetnju zdravlju i životu ljudi i životinje. Činjenica je da ELISA ima mnogo opcija (nekonkurentnih i kompetitivnih - izravnih i neizravnih), od kojih svaka rješava svoj problem i na taj način omogućuje ciljano pretraživanje.

Za otkrivanje imunoglobulina jedne ili druge klase koristi se tradicionalna polistirenska ploča (tableta) s 96 jažica, u čijim su jažicama adsorbirani rekombinantni proteini koncentrirani u čvrstoj fazi. Protutijela ili antigeni koji su dospjeli u jažicu s krvnim serumom pronalaze "poznati" predmet i s njim formiraju kompleks (AG - AT), koji će se, fiksiran enzimskim konjugatom, manifestirati kao promjena boje jažice. prilikom čitanja rezultata.

Enzimska imunoanaliza se provodi na test sustavima određene specifičnosti, izrađenim u posebnim laboratorijima i opremljenim svim potrebnim komponentama za reakciju. Istraživanja se mogu provoditi pomoću podloški ("podložaka") i spektrofotometara za očitavanje, gdje je uključen najveći broj ručnog rada. Na potpuno automatskim strojevima, koji oslobađaju laboratorijskog asistenta od monotonog ubacivanja, pranja i drugih rutinskih zadataka, naravno, brže je i praktičnije raditi, ali ne mogu si svi laboratoriji priuštiti takav luksuz i nastaviti raditi na starinski način - na poluautomatskim uređajima.

Interpretacija rezultata ELISA-e u nadležnosti je doktora laboratorijske dijagnostike, pri čemu se nužno uzima u obzir svojstvo gotovo svih imunokemijskih reakcija da daju lažno pozitivne ili lažno negativne odgovore.

Video: moderni enzimski imunotest

ELISA rezultati na primjeru sifilisa

ELISA je prikladna za otkrivanje svih oblika i, osim toga, koristi se u probirnim studijama. Za analizu se koristi venska krv pacijenta uzeta na prazan želudac. U radu se koriste ploče određene specifičnosti (AT klase A, M, G) ili ukupna antitijela.

S obzirom na to da se antitijela kod sifilisa stvaraju određenim slijedom, ELISA može lako odgovoriti na pitanje kada je došlo do infekcije i u kojoj je fazi proces, a dekodiranje dobivenih rezultata može se prikazati u sljedećem obliku:

• IgM ukazuju na trajanje zaraznog procesa (mogu se pojaviti tijekom pogoršanja kroničnih upalnih bolesti);
• IgA navode da se infekcija dogodila prije više od mjesec dana;
• IgG ukazuju na to da je infekcija u punom zamahu ili nedavno liječena, što se lako doznaje prikupljanjem anamneze.

Prilikom testiranja na sifilis, negativne jažice (i negativna kontrola) ostat će bezbojne, dok će pozitivne (poput pozitivne kontrole) pokazati svijetlo žutu boju zbog promjene boje kromogena dodanog tijekom testa. Međutim, intenzitet boje ne odgovara uvijek kontrolnom, odnosno može biti nešto blijeđi ili blago žućkasti. To su sumnjivi rezultati, koji u pravilu podliježu ponovnom ispitivanju uz obavezno razmatranje kvantitativnih pokazatelja dobivenih na spektrofotometru, ali općenito je boja izravno proporcionalna broju imunoloških kompleksa (antigena i antitijela vezanih za jedno drugo).

Najuzbudljiviji od enzimskih imunotestova - ELISA za HIV

Analiza o, možda i više od ostalih, zanima široki krug stanovništva, jer se još ne može sa sigurnošću reći da su mnogi društveni problemi (prostitucija, ovisnost o drogama i sl.) nestali. Nažalost, HIV ne pogađa samo ove dijelove ljudskog društva, možete se zaraziti pod raznim okolnostima koje nisu povezane sa seksualnim promiskuitetom ili upotrebom droga. Ali ako postoji potreba za testiranjem na HIV, onda se ne biste trebali bojati da će svi okolo saznati za posjet takvom laboratoriju. Sada su osobe zaražene HIV-om zaštićene zakonom, a oni koji sumnjaju mogu se obratiti anonimnim uredima gdje mogu riješiti problem bez straha od publiciteta i osude.

Enzimski imunotest koji se koristi za dijagnosticiranje HIV infekcije jedna je od primarnih standardnih studija, koja, međutim, zahtijeva posebne uvjete, budući da je tema vrlo osjetljiva.

Ima smisla provesti ELISA za HIV nakon seksualnog kontakta, transfuzije krvi, drugih medicinskih postupaka koji uključuju infekciju i na kraju razdoblja inkubacije (“seronegativni prozor”), ali treba imati na umu da to vremensko razdoblje nije konstantan. Može završiti za 14-30 dana, a može trajati i do šest mjeseci, pa se prosječnom vrijednošću smatra interval od 45 do 90 dana. Krv se za HIV daruje na isti način kao i za druge infekcije – iz vene natašte. Rezultati će biti gotovi ovisno o nakupljanju materijala u laboratoriju i njegovoj obimnosti (od 2 do 10 dana), iako većina laboratorija daje odgovor isti dan ili sljedeći.

Što se može očekivati ​​od rezultata HIV-a?

ELISA za HIV infekciju otkriva antitijela na dvije vrste virusa: HIV-1 (češći u Rusiji i drugim europskim i azijskim zemljama) i HIV-2 (češći u zapadnoj Africi).

Zadatak HIV ELISA-e je potraga za antitijelima klase G, koja se detektiraju na svim test sustavima, ali u kasnijem razdoblju, te antitijelima klase A i M, otkrivenim na rekombinantnim test setovima nove generacije, koji omogućuju detekciju antitijela na najranije faze (razdoblje inkubacije je seronegativni prozor). Od ELISA testa mogu se očekivati ​​sljedeći odgovori:

1. Primarni pozitivan rezultat: krv podliježe ponovnoj provjeri na testnom sustavu iste vrste, ali, ako je moguće, druge serije i od strane druge osobe (laborant);
2. Ponovljeno (+) uključuje novo uzimanje uzorka krvi od pacijenta s proučavanjem istog sličnom primarnoj analizi;
3. Sljedeći pozitivan rezultat podliježe referentnoj analizi koja koristi visoko specifične testne komplete (2-3 kom.);
4. Pozitivan rezultat u oba (ili tri) sustava šalje se na imunoblotiranje (ista ELISA, ali se izvodi pojedinačno na testnim setovima posebno visoke specifičnosti).

Zaključak o HIV infekciji donosi se samo na temelju imunoblotinga. Sa zaraženom osobom se vodi razgovor u potpunoj povjerljivosti. Odavanje liječničke tajne u Rusiji, kao iu drugim zemljama, podliježe kaznenoj kazni.

Testovi na klamidiju i citomegalovirus enzimskim imunološkim testom također su stekli posebnu popularnost zbog činjenice da vam omogućuju određivanje vremena infekcije, stadija bolesti i učinkovitosti terapijskih mjera.

Tijekom uvoda također je moguće promatrati pojavu protutijela različitih klasa. u različitim fazama patološkog stanja uzrokovanog infektivnim agensom:

• IgM se može otkriti već sedam dana nakon infekcije;
• IgA ukazuju na to da infekcija živi u tijelu više od mjesec dana;
• IgG potvrđuje dijagnozu klamidije, pomaže u praćenju liječenja i utvrđivanju njegove učinkovitosti. Valja napomenuti da antitijela klase G ostaju i cirkuliraju u tijelu bez obzira na trajanje bolesti, stoga se za ispravno tumačenje analize moraju uzeti u obzir referentne vrijednosti (norme) koje do način, različiti su za svaki CDL: uzimajući u obzir marku testnog sustava i specifičnost reagensa uključenih u set. Vrijednosti norme se unose u obrazac pored rezultata ELISA.

Što se tiče, ovdje je malo drugačije: antitijela klase M pojavljuju se za oko mjesec i pol dana, odnosno pozitivan rezultat (IgM +) postaje u fazi primarne infekcije ili tijekom reaktivacije latentne infekcije i ostaje od 4 mjeseca do šest mjeseci.

Prisutnost antitijela klase G karakteristična je za početak primarne akutne infekcije ili reinfekcije. Analiza navodi da je virus prisutan, ali ne daje podatke o stadiju zaraznog procesa. U međuvremenu, određivanje norme titra IgG također izaziva poteškoće, jer u potpunosti ovisi o imunološkom statusu određene osobe, koji se, međutim, utvrđuje detekcijom imunoglobulina klase G. S obzirom na ovakvo ponašanje antitijela, prilikom dijagnosticiranja CMVI postaje potrebno za procjenu sposobnosti protutijela klase G da stupe u interakciju s CMV-om, kako bi ga kasnije "neutralizirali" (AT avidnost). U početnoj fazi bolesti, IgG se vrlo slabo vežu na antigene virusa (niska avidnost) i tek tada počinju pokazivati ​​aktivnost, stoga možemo govoriti o povećanju avidnosti antitijela.

Dugo se može govoriti o prednostima enzimskog imunotestiranja, jer je ova metoda uspjela riješiti mnoge dijagnostičke probleme koristeći samo vensku krv. Nema potrebe za dugim čekanjem, brigama i problemima oko preuzimanja materijala za istraživanje. Osim toga, testni sustavi za ELISA nastavljaju se poboljšavati i dan kada će test dati 100% pouzdanost rezultata nije daleko.

Video: obrazovni film Moskovskog državnog medicinskog sveučilišta. Sechenov o osnovama ELISA-e

A.P. OBRYADINA, T.I. ULANOVA
LLC "Znanstveno-proizvodna udruga "Dijagnostički sustavi",

Nižnji Novgorod
ENZIMSKI IMUNSKI TEST SUSTAVI "DS-ELISA-HBeAg" i "DS-ELISA-anti-HBe" ZA SPECIFIČNU DIJAGNOSTIKU I PREDVIĐANJE ISHODA AKUTNOG I KRONIČNOG HEPATITISA B
Hepatitis B je virusna zarazna bolest koju karakterizira teška

upalne bolesti jetre. Otprilike 1% smrtnih slučajeva dogodi se u

akutno razdoblje bolesti, u 4-10% slučajeva dolazi do transformacije u kronično

proces s mogućim stvaranjem naknadne ciroze jetre i primarne

hepatokarcinomi.

Unatoč trendu pada incidencije akutnog hepatitisa B, nastavlja se formirati epidemiološki opasna skupina bolesnika kojima je prvi put dijagnosticiran kronični virusni hepatitis, kao i skupina nositelja uzročnika bolesti. Nepovoljna prognoza ostaje povezana s visokom incidencijom hepatitisa B među populacijom reproduktivne dobi, kao i među adolescentima.

Stoga su sada posebno aktualna pitanja liječenja, prevencije i dijagnoze hepatitisa B. Trenutno se za otkrivanje markera ove infekcije široko koriste metode enzimskog imunotestiranja. Najvažniji serološki markeri HBV-a uključuju e-antigen (HBeAg) i antitijela na e-antigen (anti-HBe). HBeAg je povezan s visokom infekcijom krvi, što ukazuje na aktivnu replikaciju virusa hepatitisa B (HBV). Utvrđeno je da visoki titri HBeAg odgovaraju visokoj aktivnosti DNA polimeraze i uvijek se kombiniraju s detekcijom kompletnih Dane čestica. Kada serum koji sadrži HBeAg uđe u krv zdrave osobe, rizik od infekcije je mnogo reda veličine veći nego nakon serokonverzije.

Kod akutnog hepatitisa B HBeAg se otkriva u krvi u ranim fazama infektivnog procesa već kod prvih kliničkih manifestacija bolesti, tjedan dana nakon pojave HBsAg. Akutni hepatitis B (AHB) cikličkog tijeka karakterizira kratkotrajna cirkulacija HBeAg. Ubrzo, u 2-3 tjedna ikteričnog razdoblja, pojavljuje se anti-HBe, što omogućuje predviđanje povoljnog ishoda bolesti.

Anti-HBe cirkuliraju u krvi 2-5 godina, rjeđe nekoliko mjeseci.

Početak HBeAg-antiHBe serokonverzije označava nagli pad aktivnosti

zarazni proces. Otkrivanje HBeAg u krvi bolesnika nakon 2 mjeseca bolesti ukazuje na kroničnost patološkog procesa. U tom slučaju, anti-HBe može nastati mnogo godina nakon pojave antitijela na HBcAg ili se uopće neće otkriti.

Pojava anti-HBe može imati nepovoljnu prognostičku vrijednost u

akutno razdoblje HBV-a u teškim oblicima, što odgovara mutaciji u zoni pre-core s

stvaranje HBV "e-" soja.

cilj ovaj rad bio je razvoj vrlo osjetljivih i specifičnih

ELISA test sustavi za detekciju HBeAg i anti-HBe i procjenu njihovih glavnih karakteristika.

Materijali i metode.

1. Enzimski imunološki testni sustav "DS-ELISA-HBeAg". Valjani početak testa

su kozja poliklonska antitijela na rekombinantni HBeAg, proizvedena od strane NPO Diagnostic Systems, Nižnji Novgorod, adsorbirana na čvrstoj fazi, i konjugat, koji je kozja poliklonska protutijela na rekombinantni HBeAg, obilježena peroksidazom hrena, koju proizvodi NPO Nizhny Novgorod Diagnostic Systems. Shema analize je jednostupanjski "sendvič".Ukupno vrijeme reakcije je 1,5 sati. Uzorak seruma se analizira nerazrijeđen.

2. ELISA test sustav "DS-ELISA-anti-HBe". Osnova testa je

rekombinantni HBeAg (AHBV 102), proizveden od strane NPO Diagnostic Systems,

Nižnji Novgorod, adsorbiran na čvrstoj fazi i anti-IgG konjugat s peroksidazom hrena, proizveden od strane Sorbent Service, Moskva. Reakcija se odvija u dvije faze. Ispitni serum se dodaje imobiliziranom antigenu u razrjeđenju 1/10 i nakon inkubacije i uklanjanja nevezanih komponenti detektiraju se specifični imunokompleksi pomoću mišjih monoklonskih protutijela protiv humanog IgG obilježenog peroksidazom hrena.

3. Za evaluaciju razvijenih testnih sustava korišteno je 2178 uzoraka seruma

krv. Od toga je 480 uzoraka bilo od zdravih darivatelja. 1680 uzoraka predstavlja

su uzorci krvnog seruma koji sadrže različite markere virusa hepatitisa B.

Tijekom vremena dobiveno je osamnaest uzoraka od pacijenata s kliničkom dijagnozom akutnog virusnog hepatitisa B. Prethodno su svi uzorci testirani na prisutnost HBsAg, HBeAg, anti-HBe, anti-HBc pomoću testnih sustava proizvođača NPO Diagnostic Systems, Nižnji Novgorod: "ELISA-HBsAg / m", "DS-ELISA-HBeAg", " DS-ELISA-anti-HBe", "ELISA-anti-HBc".

4. Provedena je usporedna evaluacija razvijenih testnih sustava korištenjem

komercijalni lijek "Monolisa HBe", proizvođača BIO-RAD, Francuska;

Rezultati i rasprava. NPO "Dijagnostički sustavi" razvio je 2 nova dijagnostička kompleta: "DS-ELISA-HBeAg" i "DS-ELISA-anti-HBe". Test sustav "DS-ELISA-HBeAg" dizajniran je za otkrivanje e-antigena virusa hepatitisa B u serumu (plazmi) ljudske krvi enzimskim imunotestom i može se koristiti za specifičnu dijagnozu, određivanje aktivnosti infektivnog procesa , predviđajući težinu i ishod hepatitisa B.

Test sustav "DS-ELISA-anti-HBe" je dizajniran za otkrivanje IgG protutijela na e-antigen virusa hepatitisa B u ljudskom serumu (plazmi) i može se

koristi se za predviđanje tijeka infektivnog procesa i praćenje tekuće terapije za hepatitis B.

Za proučavanje specifičnosti novih testova procijenjena je distribucija

optička gustoća (OD) uzoraka krvnog seruma koji sadrže i ne sadrže

HBeAg ili anti-HBe. Korišteni su uzorci krvnog seruma zdravih darivatelja i uzorci krvnog seruma odabrani za različite markere virusa hepatitisa B.

stanice za transfuziju krvi. Rezultati istraživanja pokazali su značajno razdvajanje dviju populacija. Vrijednosti OD uzoraka seruma koji ne sadrže HBeAg kretale su se od 0,011 do 0,111, a glavni vrh uzoraka seruma koji sadrže HBeAg kretao se od 2,186 do 3,186 (Slika 1a).

sl.1a. Distribucija OD uzoraka seruma koji sadrže i ne sadržeHBeAgu test sustavu "DS-ELISA-HBeAg»
Vrhunac koji odgovara skupini seruma s niskim OD (0,3-0,6) vjerojatno su uzorci seruma uzeti u ranim fazama infektivnog procesa.

Već u razdoblju inkubacije HBsAg i HBeAg se redovito registriraju u krvi bolesnika, što potvrđuje njihovu potencijalnu epidemiološku opasnost.

Raspon optičke gustoće uzoraka seruma koji ne sadrže anti-HBe

bio je u rasponu od 0,002 do 0,122, a glavni vršni OD uzoraka seruma koji sadrže anti-HBe bio je u rasponu od 2,431 do 3,231 (slika 1b).

Riža. 1b. Distribucija OD uzoraka seruma koji sadrže i ne sadrže anti-HBiti, u test sustavu "DS-ELISA-anti-HBeAg»
Proučavane su značajke distribucije OD anti-HBe pozitivnih uzoraka.

serum koji sadrži ( n=78) i ne sadrži HBsAg ( n=56).


Riža. 2a. HBe-pozitivne uzorke seruma koji sadržeHBsAgu test sustavu "DS-ELISA-anti-HBe».

sl.2b. Značajke distribucije OP anti-HBe-pozitivni uzorci seruma koji ne sadrže HBsAgu ispitnom sustavu "DS-ELISA-anti-HBe».
Optička gustoća 87% anti-HBe-pozitivnih uzoraka seruma koji nisu sadržavali HBsAg kretala se u rasponu od 0,41 do 0,81 (slika 2b). U isto vrijeme, samo 14% anti-HBe-pozitivnih uzoraka seruma koji sadrže HBsAg imalo je OD u ovom rasponu (slika 2a). Poznato je da u fazi kasne rekonvalescencije s negativnom reaktivnošću na HBsAg dolazi do postupnog smanjenja titra antitijela na HBeAg (slika 2b). Stoga je moguće da je prevladavajuća koncentracija anti-HBe-pozitivnih uzoraka odgovarala OD manjem od 0,8.

Dobiveni podaci ukazuju na pouzdanost odvajanja pozitivnih i

negativni uzorci krvnog seruma bez obzira na stadij bolesti. Ispitivanje osjetljivosti i specifičnosti test sustava "DS-ELISA-HBeAg" i "DS-ELISA-antiHBe" provedeno je u usporedbi s testom "Monolisa HBe" ("BIORAD", Francuska) (tablica 1).

stol 1
Usporedne karakteristike osjetljivosti i specifičnosti

test sustavi DS-ELISA-HBeAg i DS-ELISA-antiHB

Podaci prikazani u tablici 1 pokazuju 100% slaganje rezultata.

Poznato je da kombinirana indikacija HBeAg i anti-HBe, posebno njihova kvantitativna procjena, ima dodatnu prognostičku vrijednost. Brzo povećanje titra anti-HBe karakterizira aktivni humoralni imunološki odgovor i praktički eliminira prijetnju kroničnosti. Analizirali smo promjenu sadržaja HBeAg/anti-HBe u uzorcima krvnog seruma bolesnika s kliničkom dijagnozom akutnog virusnog hepatitisa B (tablica 2).

tablica 2
Dinamika HBeAg/anti-HBe serokonverzije u bolesnika s akutnim hepatitisom B

* od prijema u bolnicu
Svi uzorci seruma su testirani na prisutnost seroloških markera.

OGV: HBsAg, anti-HBc, anti-HBc IgM. Razdoblje promatranja variralo je od 13 do 38 dana. U bolesnika br. 1, br. 2 i br. 6 anti-HBe je otkriven već u pozadini smanjenja titra HBeAg. U bolesnika br. 3 i br. 4 anti-HBe se pojavio nakon nestanka HBeAg iz krvnog seruma 21. odnosno 8. dana. Analiza detekcije HBeAg u krvnom serumu bolesnika broj 5 pri prijemu u bolnicu pokazala je negativan rezultat. Istodobno, prelazak na anti-HBe registriran je već prvog dana ispitivanja.

Svi ispitanici su pokazali trend povećanja titra antitijela na HBeAg u

krvni serum, što omogućuje predviđanje povoljne dinamike klin

manifestacije OGV-a i brzi oporavak.

Proučavanje novih testnih sustava pokazalo je njihovu visoku dijagnostičku pouzdanost. Rezultati usporedbe DS-ELISA-HBeAg" i "DS-ELISA-antiHBe" pokazali su 100% slaganje s "Monolisa HBe" testom.

U proučavanju uzoraka seruma bolesnika s hepatitisom B u dinamici, testovi

potvrđena visoka osjetljivost i specifičnost.

Kratko vrijeme inkubacije proučavanih uzoraka i konjugata (1 h) omogućuje određivanje ispravne taktike za provođenje terapijskih mjera u najkraćem mogućem vremenu. Napravljeni testni sustavi su jednostavni za postavljanje, ekonomični (za određivanje HBeAg potrebno je 50 µl seruma, a za određivanje anti-HBe 10 µl seruma). Kvalitetne karakteristike testova omogućuju njihovu uspješnu primjenu u predviđanju tijeka infektivnog procesa i praćenju tekuće terapije hepatitisa B.
KNJIŽEVNOST

1.Mayer K.P. Hepatitis i posljedice hepatitisa / K.P. Mayer.– M., GEOTAR, Medicina, 1999.- C.720

2.Oniščenko G.G.Širenje virusnog hepatitisa kao prijetnja nacionalnoj sigurnosti / G.G. Oniščenko, L.A. Dementieva // Journal of microbiology. –2003.-Br.4.- Str.93-99.

3.Sorinson S.N. Virusni hepatitis / S.N.Sorinson. - Sankt Peterburg, Teza, 1997.- 306 str.

4. Baumeister M. Hepatitis B Virus e Antigen Specific Epitopes and Limitations of Commercial Anti-HBe Immunoassays / M. Baumeister // Journal of Medical Virology.- 2000.-N 60.- P.256-263.

5.Kane M. Globalni program za kontrolu infekcije hepatitisom B / M. Kane// Cjepivo. - 1995.-N131 (Suppl. 1).- R.47-6. Shunichi suboko. Sojevi virusa hepatitisa B s mutacijama u jezgri promotora u pacijenata s fulminantnim hepatitisom / Shunichi Sato, Kazuyuki Suzuki // Annals of Internal Medicine. - 1995.- N122.- R.241-248.

7. Ou J.-H. Molekularna biologija virusa hepatitisa B e antigena./ J.-H.Ou // Journal of Gastroenterology and Hepatology. - 1997.- Broj 12 (Suppl.1) - R. 178-187.

8.Tiollais P. Virus hepatitisa B. / P.Tiollais, C.Pourcel, A.Dejean // Priroda. - 1985. - Str.317, 489-495
Objavljeno: Zh. "Klinička laboratorijska dijagnostika" - 2005.-№6-S.-34-37

1 Postavite zadatak

1.1 Komplet je dizajniran za istovremenu detekciju protutijela na virus ljudske imunodeficijencije prvog i drugog tipa (HIV-1 i HIV-2) i HIV-1 p24 antigen u ljudskom serumu i plazmi „in vitro“ pomoću neizravnog enzima- vezani imunosorbentni test.

2 Karakteristike i princip rada seta

2.1 Sastav skupa:

2.2 Glavne komponente kompleta "ELISA-HIV 1.2 AGAT" su imunosorbent, otopina konjugata br.1 i konjugat br.2.

Imunosorbent je polistirenska tableta, u čijim se jažicama adsorbira mješavina rekombinantnih HIV-1 (gp41) i HIV-2 (gp36) antigena i monoklonskih antitijela na HIV-1 p24 antigen.

Otopina konjugata #1 je mješavina biotinom obilježenih monoklonskih ljudskih protutijela protiv HIV-1 p24 antigena i biotinom obilježenih rekombinantnih proteina HIV-1 i HIV-2.

Konjugat #2 je streptavidin konjugiran s peroksidazom hrena.

Uzorak pozitivne kontrole AT- ljudski krvni serum koji sadrži antitijela na HIV-1 i HIV-2, koji ne sadrži protutijela na virus hepatitisa C i Treponema pallidum, HIV-1 p24 antigen i HBs antigen, inaktiviran zagrijavanjem tijekom 3 sata na temperaturi od 56 ºC.

Uzorak pozitivne kontrole AG– ljudski krvni serum koji sadrži nativni p24 HIV-1 antigen, ne sadrži protutijela na HIV-1, HIV-2, virus hepatitisa C i Treponema pallidum i HBs antigen, inaktiviran zagrijavanjem tijekom 3 sata na temperaturi od 56 ºC.

Negativan kontrolni uzorak– ljudski krvni serum koji ne sadrži antitijela na HIV-1, HIV-2, HCV, HIV-1 p24 antigen i HBs antigen, inaktiviran zagrijavanjem tijekom 3 sata na temperaturi od 56 ºC.

Princip rada seta. Kada se otopina konjugata br. 1 i uzorci seruma inficirane krvi dodaju u jažice tablete, antigen p24 veže se i na specifična antitijela na čvrstoj fazi i na monoklonska biotinilirana anti-p24 antitijela koja su dio otopine konjugata. br. 1; HIV-specifična antitijela vežu se i na rekombinantne HIV-1 i HIV-2 antigene adsorbirane na čvrstoj fazi, i na antigene uključene u otopinu konjugata br. 1, tvoreći komplekse antigen-antitijelo. Imunološki kompleksi anti-p24 specifičnih antitijela i p24 antigena detektiraju se konjugatom br. 2. Nakon ispiranja nevezanih komponenti, u jažice ploče dodaje se otopina supstrata peroksidaze (vodikov peroksid) i TMB kromogena.

Reakcija peroksidaze se zaustavlja dodavanjem stop reagensa (0,9 M otopina sumporne kiseline) i intenzitet boje otopine u jažicama se mjeri na spektrofotometru kao vrijednost optičke gustoće (OD) na valnoj duljini od 450 nm.

Vrijednost OD je izravno proporcionalna koncentraciji specifičnih protutijela i/ili p24 antigena u uzorku seruma ili plazme. Što je veći sadržaj antitijela i/ili p24 antigena u uzorku seruma, to je veći intenzitet bojenja.

2.3 Set je dizajniran za držanje za držanje 24 produkcije ELISA: 1 postavka - 1 traka (8 rupa). Ukupno - 192 definicije uključujući kontrolne uzorke.

3 Mjere opreza pri korištenju kompleta

3.1 Sve komponente kompleta u korištenim koncentracijama su netoksične. Međutim, raditi sa svim ispitanim uzorcima ljudskog seruma (plazme), koji se trebaju smatrati potencijalno zaraženim, sposobnim za pohranu i prijenos HIV-a, virusa hepatitisa B ili bilo kojeg drugog uzročnika virusne infekcije, s istrošenim otopinama i tekućinama, različitom opremom koja može biti kontaminiran u procesu analize zahtijeva određene sigurnosne mjere pri korištenju kompleta:

Rad se mora izvoditi u posebno opremljenoj prostoriji;

Potrebno je raditi uz korištenje osobne zaštitne opreme i uz poštivanje mjera opreza u skladu sa zahtjevima , , i .

3.2 Stop reagens koji sadrži sumpornu kiselinu je iritantan. U slučaju dodira s kožom i sluznicama, odmah isprati s puno vode.

3.3 Prilikom rada s kompletom radna mjesta moraju biti opremljena dovodnom i ispušnom ventilacijom.

3.4 Sve osobe koje rade u laboratoriju s priborom moraju se podvrgnuti obveznom liječničkom pregledu u skladu sa zahtjevima.

3.5 Medicinski otpad i/ili neiskorišteni kompleti kojima je istekao rok valjanosti moraju se pravilno zbrinuti.

4 Pravila za rad sa setom

4.1 Kako bi se isključili lažni rezultati, uzorci za ispitivanje moraju se pripremiti i pohraniti u uvjetima koji sprječavaju rast bakterija. Uzorke seruma koji sadrže agregirane komponente seruma ili sediment treba razbistriti centrifugiranjem (5-10) minuta na 3000 o/min. Uzorci seruma mogu se čuvati na (2-8) °C ne više od 5 dana. Smrznuti uzorci (po mogućnosti na temperaturi od najmanje minus 20 °C) mogu se čuvati najviše 1 godinu. Treba izbjegavati ponovljene cikluse smrzavanja i odmrzavanja uzoraka.

Treba imati na umu da uzorci s hemolizom, hiperlipidemijom, rastom bakterija, kao i oni koji su dugo pohranjeni bez zamrzavanja nisu prikladni za analizu.

Pouzdanost rezultata ovisi o sljedećim pravilima:

Nije dopušteno korištenje kompleta nakon isteka roka valjanosti, kao ni miješanje komponenti kompleta iz različitih serija;

Za pripremu svakog reagensa potrebno je koristiti poseban spremnik;

Ne tretirajte sav pribor koji se koristi za pripremu reagensa dezinficijensima i deterdžentima. Ako je potrebno, isperite pitkom vodom, a zatim pet puta isperite destiliranom vodom;

Za rad s TMB i RX kromogenom potrebno je koristiti zasebne posude za otopine, vrhove pipeta i posude.

Mora se paziti da se reagensi temeljito promiješaju;

Vrijeme između punjenja i pražnjenja jažica ploče s otopinama i reagensima treba biti najmanje 30 s. Nije dopušteno sušiti jažice u svim fazama postavljanja ELISA;

Kada koristite perilicu, pratite stanje posude s otopinom za pranje ploče i spojnih crijeva: ne smiju pokazivati ​​znakove rasta bakterija ili gljivica;

Potrebno je koristiti automatske pipete s izmjenjivim vrhovima, ovjerene vrijednošću prosječne doze i konvergencijom rezultata pipetiranja (pogreška ne veća od 3%);

Dispenzere i radne površine treba obraditi otopinom s volumnim udjelom etilnog alkohola od 70%. Nemojte koristiti kloramin i druge tvari koje sadrže klor;

Za rukovanje ispitnim i kontrolnim uzorcima preporuča se korištenje jednokratnih vrhova za pipete. Svaki uzorak seruma, kao i kit reagensa, mora se prikupiti posebnim vrhom.

Prilikom unošenja u jažice PK-1 vrhom pipete ne dirajte površinu tablete i otopinu u jažicama.

Tijekom analize izbjegavajte izravnu sunčevu svjetlost na radnoj površini.

4.2 Prilikom otvaranja i otapanja liofiliziranih komponenti potrebno je osigurati da na poklopcu i stijenkama bočica ne ostane suha tvar.

5 Oprema i materijali potrebni za analizu

5.1 Vertikalni skenirajući spektrofotometar, koji omogućuje mjerenje optičke gustoće otopina u jažicama tablete na valnoj duljini od 450 nm;

Polu- ili automatski uređaj za pranje tableta (perilica);

Termostat za suhi zrak tipa TC-80 M2, koji održava temperaturu od (37 ± 1) °C, ili sličnih karakteristika;

Jednokanalne automatske pipete s izmjenjivim vrhovima, koje omogućuju uzimanje tekućine od 0,01 do 5,0 ml;

Pipete 8-kanalne automatske s izmjenjivim vrhovima, omogućujući odabir tekućine do 0,5 ml;

Mjerni cilindar kapaciteta 2000 ml;

Laboratorijska tikvica kapaciteta 2000 ml;

Staklene boce kapaciteta 20 ml;

Posude za reagense ili Petrijeve zdjelice (promjer 100 mm);

Medicinska higroskopna vata;

Filter papir;

Gumene kirurške rukavice;

Otopina s volumnim udjelom etilnog alkohola 70%;

Otopina s masenim udjelom vodikovog peroksida 6%;

Deionizirana ili destilirana voda;

Spremnik za skupljanje krutog otpada;

Spremnik za odvod tekućeg otpada.

6 Priprema za analizu

6.1 Prije analize izvadite komplet reagensa iz hladnjaka, otvorite poklopac kutije i držite komponente kompleta na temperaturi (18-25) °C 30 min.

Prije analize temeljito pomiješajte sve uzorke seruma (plazme) i reagense.

Potrošnja reagensa testnog kompleta, koja je određena brojem korištenih traka, navedena je u tablici A.1 Dodatka A.

6.2 Priprema otopine za ispiranje ploča

Pažnja! Pripremite otopinu za pranje ploče 15 minuta prije početka analize!

Ako bočica s FSB-T × 25 sadrži talog, mora se prije upotrebe zagrijati na temperaturi od (37 ± 1) °C dok se talog potpuno ne otopi. U mjerni cilindar kapaciteta 2000 ml dodajte sadržaj bočice s FSB-T × 25, a zatim dolijte destiliranu vodu do oznake 1250 ml i lagano promiješajte otopinu. Otopina se može čuvati na (2-8) °C 72 sata.

U slučaju korištenja jedne ili više traka, snažno protresite sadržaj bočice s FSB-T × 25 tijekom (20-30) s, uzmite potreban volumen otopine (Tablica A.1) u mjernu čašicu ili cilindar , dodajte potrebnu količinu destilirane vode i promiješajte otopinu . Neiskorišteni FSB-T×25 može se čuvati u zatvorenoj bočici na temperaturi od (2-8) °C tijekom roka valjanosti kompleta.

6.3 Imunosorbentni pripravak

Imunosorbent je spreman za upotrebu.

Otvorite paket i ugradite potreban broj traka na okvir. Preostale trake čuvajte u dobro zatvorenoj vrećici s sredstvom za sušenje na (2-8) °C 3 mjeseca.

6.4 Priprema K + AT, K - , RK-1, PP-K2, BRS i stop reagensa

K + AT, K - , RK-1, RR-K2, BRS i stop reagens spremni su za upotrebu.

Pažnja! Moguća je oborina u bočici s RK-1. Supernatant se mora koristiti za analizu.

Neiskorišteni RK-1, PP-K2, BRS i stop reagens nakon otvaranja bočica mogu se čuvati u zatvorenim bočicama na temperaturi od (2-8) °C tijekom roka valjanosti kompleta.

Ostatak K + AT i K - nakon otvaranja boce može se čuvati u zatvorenim bocama na temperaturi od (2-8) °C tijekom roka valjanosti kompleta.

6.5 Priprema otopine K + AG

Pažnja! Otopinu K + AG treba pripremiti 15 minuta prije početka analize!

Za obnavljanje liofiliziranog K + AG, prije otvaranja bočice, lagano tapkajući kako biste otresli čestice koje su prianjale za stijenke bočice ili čepa. Otvorite bočicu i stavite čep naopako na suhu površinu. Dodajte 0,8 ml destilirane vode u bočicu. Bočicu zatvorite čepom, držite 10 minuta na temperaturi od (18-25) °C i lagano nagnite i rotirajte bočicu, miješajte njezin sadržaj dok se potpuno ne otopi, izbjegavajući stvaranje pjene.

Rekonstituirani K + AG može se čuvati u zatvorenoj bočici na temperaturi od (2-8) °C mjesec dana, na temperaturi od minus 20 °C - šest mjeseci. Dopušteno je jednokratno zamrzavanje-odmrzavanje obnovljenog K + AG.

6.6 Priprema otopine Kg-2 u radnom razrjeđenju

Uzmite volumen naveden u tablici A.1 iz bočice s Kg-2 i prenesite ga u bočicu s PP-K2. Temeljito promiješajte sadržaj bočice, izbjegavajući stvaranje pjene.

Ako se koristi jedna ili više traka, potrebnu količinu PP-K2 uzmite u čistu bočicu, dodajte Kg-2 u skladu s tablicom A.1 i pomiješajte otopinu bez stvaranja pjene.

Pažnja! Kg-2 otopina u radnom razrjeđenju priprema se neposredno prije upotrebe! Kg-2 otopina u radnom razrjeđenju može se čuvati 15 minuta na temperaturi od (18-25) °C. Koristite samo novu ladicu za reagens i nove savjete!

Ostatak Kg-2 može se čuvati u zatvorenoj bočici na temperaturi od (2-8) °C tijekom roka valjanosti kompleta.

6.7 Priprema otopine radne podloge

Boca s TMB kromogenom mora se prije upotrebe zagrijati na temperaturi od (37±1)° C do potpunog otapanja kristala.

Uzmite volumen naveden u tablici A.1 iz bočice s TMB kromogenom i prenesite ga u bočicu s BRS. Temeljito promiješajte sadržaj bočice, izbjegavajući stvaranje pjene.

Ako se koristi jedna ili više traka, uzmite potrebnu količinu BRS-a u čistu bočicu, dodajte TMB kromogen u skladu s tablicom A.1 i pomiješajte otopinu bez stvaranja pjene.

Pažnja! Radna otopina podloge priprema se neposredno prije upotrebe na mjestu zaštićenom od svjetlosti! Otopina se može čuvati 20 minuta na temperaturi od (18-25) °C, zaštićena od svjetlosti.

Otopina mora biti zaštićena od svjetlosti i kontakta s metalima ili metalnim ionima. Otopina supstrata prije upotrebe mora biti bezbojna. Posuđe koje će tijekom reakcije biti u kontaktu s otopinom supstrata treba prati bez upotrebe sintetskih deterdženata. Koristite samo novu ladicu za reagens i nove savjete!

Ostatak TMB kromogena može se čuvati u zatvorenoj bočici na temperaturi od (2-8) °C tijekom roka valjanosti kompleta.

7 Zahtjevi za pranje tanjura

U svim fazama pranja potrebno je kontrolirati punjenje svih jažica i potpuno uklanjanje (aspiraciju) tekućine iz njih;

Potrebno je pri svakom pranju sve jažice napuniti otopinom do vrha (0,30-0,35 ml po jažici), bez prelijevanja i prelijevanja tekućine iz susjednih jažica;

Jažice držite napunjene otopinom za ispiranje ploča 30 s;

Prilikom svake aspiracije pažljivo uklonite preostalu tekućinu iz jažica tako što ćete okvir s trakama u obrnutom položaju tapkati po nekoliko puta presavijenom filter papiru, stavljenom na list polietilena;

Loše pranje ploče dovodi do netočnih rezultata.

8 Provođenje analize

8.1 U bilo koje dvije jažice tablete dodati 0,07 ml(70 µl) K + AT, u druga dva bunara - po 0,07 ml(70 µl) K + AG, u tri druge rupe - po 0,07 ml(70 µl) DO - .

Pažnja! Prilikom postavljanja ELISA na jednu traku, dopušteno je koristiti dvije jažice za K - - jednu jažicu, za K + AT - jednu jažicu, za K + AG - jednu jažicu.

U preostale jažice tablete dodajte 0,07 ml(70 µl) proučavanih uzoraka ljudskog seruma (plazme).

Pažnja! Svaki uzorak se mora uzeti jednokratnim vrhom!

8.2 U sve jažice tablete preko kontrolnih uzoraka i testnih uzoraka krvnog seruma (plazme) odmah doprinijeti 0,05 ml(50 µl) RK-1. Pomiješajte sadržaj jažica laganim tapkanjem po rubovima ploče.

8.3 (37 ± 1) ° Iznutra 60 min.

Pažnja! Za (1-2) minute prije kraja inkubacije pripremite otopinu Kr-2 u radnom razrjeđenju (odjeljak 6.6).

8.4 Uklonite sadržaj jažica peračem, zatim operite jažice ploče otopinom za ispiranje ploča (korak 6.2) sedam puta.

8.5 Dodajte u sve jažice ploče 0,15 ml(150 µl) otopine kg-2 u radnom uzgoju (točka 6.6).

8.6 Ploču zatvorite filmom ili pokrijte poklopcem i inkubirajte u termostatu na temperaturi (37 ± 1) ° Iznutra 10 minuta.

8.7 Uklonite sadržaj jažica ploče s podloškom za pranje, zatim operite jažice ploča otopinom za pranje ploče (odjeljak 6.2) sedam puta.

8.8 Uneti u sve jažice tablete 0,15 ml(150 µl) radna otopina supstrata(članak 6.7).

Prilikom pripreme radne otopine supstrata (točka 6.7.) f lacon s TMB kromogenom mora se zagrijavati prije upotrebe (3-5) minuta na temperaturi od (37± 1) °C dok se kristali potpuno ne otope.

8.9 Ploču zatvorite filmom ili pokrijte poklopcem i inkubirajte u termostatu na temperaturi (37 ± 1) ° S na tamnom mjestu za 15 minuta.

Pažnja! Na kraju inkubacije u jažicama s uzorcima seruma koji sadrže antitijela na HIV-1 i/ili HIV-2 i/ili HIV-1 p24 antigen, boja otopine će se promijeniti od bezbojne do plave različitog intenziteta ovisno o koncentraciji antitijela i/ili antigena u uzorku test seruma.

8.10 Zaustavite reakciju peroksidaze dodavanjem u sve jažice 0,05 ml(50 µl) stop reagens.

Pažnja! Jažice s uzorcima seruma koji sadrže antitijela na HIV-1 i/ili HIV-2 i/ili HIV-1 p24 antigen promijenit će boju otopine iz plave u žutu različitog intenziteta.

8.11 Najkasnije (1-2) minute nakon zaustavljanja reakcije, odrediti OD u jažicama u jednovalnom modu na valnoj duljini 450 nm.

9 Obrada rezultata analize

9.2 Rezultati se uzimaju u obzir samo ako:

Vrijednost OPsr K - ne prelazi 0,2 OE;

Svaka pojedinačna vrijednost OP K - ne smije odstupati od OPs K - više od 30%. Ako jedna od tri vrijednosti OP K - prelazi ovu granicu, treba je isključiti iz izračuna OP K - . Ako su dvije od tri vrijednosti ODK izvan ove granice, test treba ponoviti na novom setu reagensa;

Vrijednost OPsr K + AT veća od 1,0 OE;

Vrijednost OPsr K + AG je veća od 1,0 OE.

9.3 Ako su gore navedeni uvjeti ispunjeni, izračunajte kritičnu vrijednost (OPcrit.), OE, prema formuli (1):

OPcrit. = OPsr K - + 0,14 (1).

10 Analitičke i dijagnostičke karakteristike

Osjetljivost komplet reagensa ELISA-HIV 1.2 AGAT za detekciju HIV-1 p24 antigena –

Specifičnost komplet reagensa ELISA-HIV 1.2 AGAT– 100% standardni AT(-)HIV. Standardna ploča seruma koji ne sadrže protutijela na virus humane imunodeficijencije prvog i drugog tipa (HIV-1,2) i antigen HIV-1 (p24). CJSC MBS.

11 Obrazac za otpuštanje kompleta

11.1 Set je dostupan u pet konfiguracija:

1 set 1P - ručna analiza. Komplet je dizajniran za 12 ELISA testova na sklopivoj ploči: 1 rad - 1 traka (8 rupa). Ukupno - 96 određivanja, uključujući kontrolne uzorke;

2 set 2M - ručna analiza. Komplet je dizajniran za 2 ELISA ispitivanja na monolitnim pločama: 1 ispitivanje - 1 ploča. Ukupno - 192 određivanja, uključujući kontrolne uzorke;

3 postaviti 2P- ručna analiza. Set je dizajniran za držanje 24 produkcije ELISA za 2 sklopivi x tablete: 1 postavka - 1 traka (8 rupa). Ukupno - 192 definicije, uključujući kontrolne uzorke;

4 set A2M - analiza na automatskom analizatoru. Komplet je dizajniran za 2 ELISA ispitivanja na monolitnim pločama: 1 ispitivanje - 1 ploča. Ukupno - 192 određivanja, uključujući kontrolne uzorke;

5 set A2P - analiza na automatskom analizatoru. Komplet je dizajniran za 24 ELISA ispitivanja na 2 sklopive ploče: 1 rad - 1 traka (8 rupa). Ukupno 192 određivanja, uključujući kontrolne uzorke.

12 Uvjeti skladištenja i uporabe kompleta

12.1 Komplet treba čuvati u čistoj, zaštićenoj od vlage i svjetlosti prostoriji na temperaturi od (2-8)°C tijekom cijelog roka trajanja. Nemojte zamrzavati komponente kompleta.

12.2 Za dobivanje pouzdanih rezultata potrebno je strogo pridržavanje uputa za uporabu kompleta.

12.3 Rok valjanosti kompleta 12 mjeseci.

Dodatak A

Tablica A.1 - Potrošnja reagensa ELISA kompleta

Bibliografija